本研究利用piggybac轉(zhuǎn)座子為載體將嗜熱菌糖苷酶（LacS）基因整合到牛成纖維細(xì)胞的基因組中，并分析了piggybac轉(zhuǎn)座子在牛成纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)座效率和轉(zhuǎn)座位點(diǎn)的特性。同時(shí)，在研究中探討了轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶二元載體轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞時(shí)的最佳比例。1．從Puc57載體上克隆的LacS和BLG表達(dá)框與從pZGL載體上克隆到的ZGL表達(dá)框相連，并且擴(kuò)增ZGL表達(dá)框時(shí)設(shè)計(jì)的上游引物中引入NotⅠ、AflⅡ、NheⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物引入SalⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)，兩個(gè)表達(dá)框經(jīng)酶切連接后得到質(zhì)粒pZGL-LacS，測序鑒定。2．通過PCR從pLOX-EGFP上克隆PGK-NEO片段，并在設(shè)計(jì)引物時(shí)在上游引物5端引入NheⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物3端加2A和BamHⅠ，然后用NheI，BamHI酶切將得到的片段連接到pEGPF-N1載體中，新構(gòu)建的質(zhì)粒記為pEGFP-NEO-N1，再從此質(zhì)粒上克隆PGK-NEO-EGFP表達(dá)框，然后用NheⅠ和AflⅡ雙酶切，連接到已經(jīng)構(gòu)建好的載體pZGL-LacS中，測序鑒定。3．將轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶載體以5：1的比例轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分別以1：30,1... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：44 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

DNA轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制（a）復(fù)制型轉(zhuǎn)座（b）非復(fù)制型轉(zhuǎn)座Figure1ThetranspositionoftheDNAtransposon（a）replicatetransposition（b）non-replicatetransposition

圖 2 PiggyBac 轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)示意圖Figure 2 PiggyBac transposon structure diagram1.2.2 PiggyBac 轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制一般來說 DNA 轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座過程中都需要合成 DNA，然而 PiggyBac 轉(zhuǎn)座子卻不用，PiggyBac 轉(zhuǎn)座酶識(shí)別供體 DNA 上 13bp 的反向重復(fù)序列，將目的基因剪切下來，剪切下的 DNA 片段上的 TTAA 與互補(bǔ)鏈的 3’OH 形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，插入到受體上時(shí)發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，解放的 3’OH 與插入位點(diǎn)的 TTAA 共價(jià)結(jié)合，供體的 TTAA 與受體的 TTAA 互補(bǔ)配對(duì)，修復(fù) DNA 鏈完成轉(zhuǎn)座，無 DNA 合成（如圖 3）。轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座過程中轉(zhuǎn)座酶起著非常重要的作用。研究表明很多轉(zhuǎn)座酶都屬于 DDE 重組酶（具有進(jìn)化保守性氨基酸兩個(gè) Asp 和一個(gè) Glu 的三聯(lián)體）家族。它具有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)的催化位點(diǎn)，能識(shí)別和剪切核苷酸序列，并且可以把供體片段 3’OH 與插入位點(diǎn)直接連接。1.2.3 PiggyBac 轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 5鼠。試驗(yàn)中 PiggyBac 轉(zhuǎn)座子為載體得到的轉(zhuǎn)基因小鼠數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于隨機(jī)整后為了證明外源整合基因在小鼠中的遺傳穩(wěn)定性，將野生型小鼠的轉(zhuǎn)基因，得到的后代中外源基因同樣表達(dá)。因此 PiggyBac 轉(zhuǎn)座子在哺乳動(dòng)物中不效的轉(zhuǎn)座并且轉(zhuǎn)座的外源基因是在下一代中穩(wěn)定表達(dá)的。


本文編號(hào)：3004262