發(fā)布時間：2021-01-26 01:21

　　豬繁殖與呼吸綜合征Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是一種能引起母豬流產(chǎn)等生殖障礙和仔豬呼吸功能障礙癥狀為主的高度接觸性傳染病。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是一種有囊膜的、單股正鏈RNA病毒。PRRS在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，嚴重危害著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，為預(yù)防及控制PRRSV的蔓延，急需研制出安全高效的PRRS疫苗。第一，由于現(xiàn)有動物疫苗接種動物后，均有一個時間長短不一的有效抗體產(chǎn)生期（即免疫空白期），此時動物一旦遇到病原微生物的侵襲，往往造成疫病流行；第二，疫苗接種隱性感染動物，常會引起較大副反應(yīng)，甚至引起少數(shù)動物死亡；第三，分子疫苗免疫效力普遍不如常規(guī)疫苗。針對以上幾個問題，本研究旨在研制具有基因治療和免疫功能的PRRS雙功能疫苗，以期在較短的時間內(nèi)借助基因治療作用，解決PRRS免疫中存在的免疫空白期感染及隱性感染等問題，并取得了以下結(jié)果：1.設(shè)計合成針對PRRSV ORF7的2條SH寡核苷酸鏈，退火形成帶有粘性末端的SH片段，將其連接到pAAV-U6-IRES-hrGFP載體中并命名為pAAV-U6-IRES... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

rAAV-shRNA-ORF5-ORF6的構(gòu)建策略Fig.2.1TheconstructionprocessofrAAV(A)SHwasinsertedtopAAV-U6-IRES-hrGFPatCMS1site;(B)Secondly,theORF5geneandORF6genewereinsertedtopAAV-U6-IRES-hrGFP-SHatCMS2site;(C)pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6,andtwohelperplasmids,

圖 2.2 ORF5、ORF6 基因的擴增Fig.2.2 Electrophoresis of amplified ORF5 and ORFM: 2000 Marker; 1: ORF5 (about 630 bp); 3: ORF6 (about 520 bp); 2, 重組載體鑒定結(jié)果1 pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA 鑒定的結(jié)果體 pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA 測序結(jié)果顯示 SH 片段已經(jīng)插對照質(zhì)粒測序結(jié)果顯示 N-SH 已插入。2 pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 鑒定的結(jié)果陽性質(zhì)粒以及雙酶切的陽性質(zhì)粒進行瓊脂糖凝膠電泳。同時用質(zhì)粒為模板進行的 PCR 鑒定（見圖 2.3）。結(jié)合 DNA 測序結(jié)果 pAAV-U6-IRES-hrGFP 質(zhì)粒上，從而雙效表達重組載體U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 構(gòu)建成功，并得到對照質(zhì)粒V-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6。

pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 的 PCR 鑒定以及雙酶tion of pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 by PCR and doF5（about 630 bp）；3：ORF6（about 520 bp）；5：pAAV-U6-IRES-h)；6：pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 (indigestion)；Marker.ORF5-ORF6 的制備病毒包裝過程中病毒包裝組的培養(yǎng)基顏色由紅逐漸變黃下部分細胞變圓并聚集漂浮于培養(yǎng)基中，而以上現(xiàn)象在圖 2.4)。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]PCR擴增的shRNA表達盒快速篩選PRRSV有效siRNA序列[J]. 賀云霞,華榮虹,周艷君,安同慶,仇華吉,王云峰,童光志.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2007(05)
[2]一種快速高效分離和純化重組腺病毒伴隨病毒載體的方法[J]. 吳小兵,董小巖,伍志堅,屈建國,侯云德.  科學(xué)通報. 2000(19)



本文編號：3000229