類(lèi)NADC30豬繁殖與呼吸綜合征病毒FJZ03株感染性克隆的構(gòu)建及鑒定
發(fā)布時(shí)間：2021-01-23 06:14
為構(gòu)建類(lèi)NADC30豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）FJZ03株的感染性克隆,本研究將該株病毒全基因組分成6段,通過(guò)同義突變將其中的A14378G,引入了Mlu I酶切位點(diǎn)為分子標(biāo)記。經(jīng)RT-PCR分別擴(kuò)增后,克隆至改造后的載體pSK中構(gòu)建中間質(zhì)粒。經(jīng)測(cè)序鑒定各質(zhì)粒正確后,分段連接至pSK中構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒pSKFJZ03。將鑒定正確的pSK-FJZ03轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞并傳代,收集出現(xiàn)CPE后的病毒液,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)Mlu I酶切和測(cè)序鑒定;同時(shí)采用激光共聚焦試驗(yàn)鑒定,獲得的拯救病毒命名為RvFJZ03。分別測(cè)定RvFJZ03在Marc-145細(xì)胞與潴肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）中的生長(zhǎng)曲線,比較拯救病毒與親本病毒的生長(zhǎng)特性。將獲得的拯救病毒RvFJZ03在Marc-145細(xì)胞中連續(xù)傳代,對(duì)不同代次的重組病毒分別測(cè)定病毒效價(jià),并經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后通過(guò)Mlu I酶切和測(cè)序鑒定。測(cè)序鑒定結(jié)果表明,正確構(gòu)建了感染性克隆質(zhì)粒pSK-FJZ03;將其轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后并傳至第3代出現(xiàn)典型CPE,經(jīng)激光共聚焦試驗(yàn)、RT-PCR及測(cè)序鑒定表明拯救了重組病毒Rv...
【文章來(lái)源】：中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,42(11)北大核心
【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)
【部分圖文】：
拯救病毒PCR產(chǎn)物的Mlu I酶切（A）和測(cè)序（B）鑒定結(jié)果
拯救病毒Rv FJZ03的激光共聚焦鑒定結(jié)果
拯救病毒Rv FJZ03和親本病毒FJZ03的多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果顯示，拯救病毒Rv FJZ03在Marc-145細(xì)胞和PAMs細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線均與親本病毒FJZ03相似，無(wú)明顯差異（圖3）。表明拯救病毒Rv FJZ03的生長(zhǎng)特性與親本病毒FJZ03株相一致，這為利用該拯救病毒研究該類(lèi)病毒致病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明，類(lèi)NADC30株對(duì)仔豬的致病性與NADC30相似但低于HP-PRRSV，屬于中等毒力的病毒[12,17]。此外，本研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)商品化的PRRS減毒活疫苗不能對(duì)FJZ03株感染的仔豬產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)作用[12]。目前，人們對(duì)類(lèi)NADC30株的致病機(jī)理、病毒毒力變異等問(wèn)題尚不十分清楚，反向遺傳技術(shù)為PRRSV的致病分子機(jī)制研究提供了非常有效的途徑。因此，本研究構(gòu)建帶有遺傳標(biāo)記Mlu I酶切位點(diǎn)的類(lèi)NADC30 FJZ03株的感染性c DNA克隆，拯救出與親本病毒增殖特性相似的重組病毒，且其可以穩(wěn)定傳代，這為進(jìn)一步研究該類(lèi)病毒的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬繁殖與呼吸綜合征病毒類(lèi)NADC30毒株FJZ03的致病性分析[J]. 劉建奎,范佳霖,魏春華,李艷,劉佳悅,馬露露,虞慧蕓,戴愛(ài)玲,楊小燕. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(06)
[2]中國(guó)豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行歷史及現(xiàn)狀[J]. 郭振華,陳鑫鑫,李睿,喬松林,郭軍慶,張改平. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(01)
[3]2016年我國(guó)部分地區(qū)類(lèi)NADC30新亞群豬繁殖與呼吸綜合征病毒的遺傳變異分析[J]. 張洪亮,張晶,李真,張文立,劉春曉,陳家锃,相麗潤(rùn),冷超糧,彭金美,王倩,白云,安同慶,童光志,蔡雪輝,田志軍. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(09)
[4]福建地區(qū)PRRSV分離株Nsp2基因新變異序列鑒定[J]. 劉建奎,魏春華,楊小燕,戴愛(ài)玲,李曉華,潘秀珍,危美康. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2013(04)
[5]高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鑒定[J]. 張善瑞,周艷君,朱建平,童武,姜一峰,童光志. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2011(07)
本文編號(hào)：2994710
【文章來(lái)源】：中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,42(11)北大核心
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【部分圖文】：
拯救病毒PCR產(chǎn)物的Mlu I酶切（A）和測(cè)序（B）鑒定結(jié)果
拯救病毒Rv FJZ03的激光共聚焦鑒定結(jié)果
拯救病毒Rv FJZ03和親本病毒FJZ03的多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果顯示，拯救病毒Rv FJZ03在Marc-145細(xì)胞和PAMs細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線均與親本病毒FJZ03相似，無(wú)明顯差異（圖3）。表明拯救病毒Rv FJZ03的生長(zhǎng)特性與親本病毒FJZ03株相一致，這為利用該拯救病毒研究該類(lèi)病毒致病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明，類(lèi)NADC30株對(duì)仔豬的致病性與NADC30相似但低于HP-PRRSV，屬于中等毒力的病毒[12,17]。此外，本研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)商品化的PRRS減毒活疫苗不能對(duì)FJZ03株感染的仔豬產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)作用[12]。目前，人們對(duì)類(lèi)NADC30株的致病機(jī)理、病毒毒力變異等問(wèn)題尚不十分清楚，反向遺傳技術(shù)為PRRSV的致病分子機(jī)制研究提供了非常有效的途徑。因此，本研究構(gòu)建帶有遺傳標(biāo)記Mlu I酶切位點(diǎn)的類(lèi)NADC30 FJZ03株的感染性c DNA克隆，拯救出與親本病毒增殖特性相似的重組病毒，且其可以穩(wěn)定傳代，這為進(jìn)一步研究該類(lèi)病毒的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬繁殖與呼吸綜合征病毒類(lèi)NADC30毒株FJZ03的致病性分析[J]. 劉建奎,范佳霖,魏春華,李艷,劉佳悅,馬露露,虞慧蕓,戴愛(ài)玲,楊小燕. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(06)
[2]中國(guó)豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行歷史及現(xiàn)狀[J]. 郭振華,陳鑫鑫,李睿,喬松林,郭軍慶,張改平. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(01)
[3]2016年我國(guó)部分地區(qū)類(lèi)NADC30新亞群豬繁殖與呼吸綜合征病毒的遺傳變異分析[J]. 張洪亮,張晶,李真,張文立,劉春曉,陳家锃,相麗潤(rùn),冷超糧,彭金美,王倩,白云,安同慶,童光志,蔡雪輝,田志軍. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(09)
[4]福建地區(qū)PRRSV分離株Nsp2基因新變異序列鑒定[J]. 劉建奎,魏春華,楊小燕,戴愛(ài)玲,李曉華,潘秀珍,危美康. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2013(04)
[5]高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鑒定[J]. 張善瑞,周艷君,朱建平,童武,姜一峰,童光志. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2011(07)
本文編號(hào)：2994710
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