為構建類NADC30豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）FJZ03株的感染性克隆,本研究將該株病毒全基因組分成6段,通過同義突變將其中的A14378G,引入了Mlu I酶切位點為分子標記。經RT-PCR分別擴增后,克隆至改造后的載體pSK中構建中間質粒。經測序鑒定各質粒正確后,分段連接至pSK中構建全長cDNA克隆質粒pSKFJZ03。將鑒定正確的pSK-FJZ03轉染Marc-145細胞并傳代,收集出現(xiàn)CPE后的病毒液,經RT-PCR擴增后的產物經Mlu I酶切和測序鑒定;同時采用激光共聚焦試驗鑒定,獲得的拯救病毒命名為RvFJZ03。分別測定RvFJZ03在Marc-145細胞與潴肺泡巨噬細胞（PAMs）中的生長曲線,比較拯救病毒與親本病毒的生長特性。將獲得的拯救病毒RvFJZ03在Marc-145細胞中連續(xù)傳代,對不同代次的重組病毒分別測定病毒效價,并經RT-PCR擴增后通過Mlu I酶切和測序鑒定。測序鑒定結果表明,正確構建了感染性克隆質粒pSK-FJZ03;將其轉染Marc-145細胞后并傳至第3代出現(xiàn)典型CPE,經激光共聚焦試驗、RT-PCR及測序鑒定表明拯救了重組病毒Rv... 

【文章來源】：中國預防獸醫(yī)學報. 2020,42(11)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

拯救病毒PCR產物的Mlu I酶切（A）和測序（B）鑒定結果

拯救病毒Rv FJZ03的激光共聚焦鑒定結果

拯救病毒Rv FJZ03和親本病毒FJZ03的多步生長曲線測定結果顯示，拯救病毒Rv FJZ03在Marc-145細胞和PAMs細胞中的生長曲線均與親本病毒FJZ03相似，無明顯差異（圖3）。表明拯救病毒Rv FJZ03的生長特性與親本病毒FJZ03株相一致，這為利用該拯救病毒研究該類病毒致病的分子機制奠定基礎。本研究團隊前期研究結果表明，類NADC30株對仔豬的致病性與NADC30相似但低于HP-PRRSV，屬于中等毒力的病毒[12,17]。此外，本研究團隊證實商品化的PRRS減毒活疫苗不能對FJZ03株感染的仔豬產生良好的免疫保護作用[12]。目前，人們對類NADC30株的致病機理、病毒毒力變異等問題尚不十分清楚，反向遺傳技術為PRRSV的致病分子機制研究提供了非常有效的途徑。因此，本研究構建帶有遺傳標記Mlu I酶切位點的類NADC30 FJZ03株的感染性c DNA克隆，拯救出與親本病毒增殖特性相似的重組病毒，且其可以穩(wěn)定傳代，這為進一步研究該類病毒的致病機制奠定基礎。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬繁殖與呼吸綜合征病毒類NADC30毒株FJZ03的致病性分析[J]. 劉建奎,范佳霖,魏春華,李艷,劉佳悅,馬露露,虞慧蕓,戴愛玲,楊小燕.  畜牧獸醫(yī)學報. 2018(06)
[2]中國豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行歷史及現(xiàn)狀[J]. 郭振華,陳鑫鑫,李睿,喬松林,郭軍慶,張改平.  畜牧獸醫(yī)學報. 2018(01)
[3]2016年我國部分地區(qū)類NADC30新亞群豬繁殖與呼吸綜合征病毒的遺傳變異分析[J]. 張洪亮,張晶,李真,張文立,劉春曉,陳家锃,相麗潤,冷超糧,彭金美,王倩,白云,安同慶,童光志,蔡雪輝,田志軍.  中國預防獸醫(yī)學報. 2016(09)
[4]福建地區(qū)PRRSV分離株Nsp2基因新變異序列鑒定[J]. 劉建奎,魏春華,楊小燕,戴愛玲,李曉華,潘秀珍,危美康.  中國預防獸醫(yī)學報. 2013(04)
[5]高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鑒定[J]. 張善瑞,周艷君,朱建平,童武,姜一峰,童光志.  中國預防獸醫(yī)學報. 2011(07)



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