產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）是引起嬰幼兒和幼畜腹瀉的主要病原體之一,感染者常因劇烈水樣腹瀉和迅速脫水而死亡,給人類的健康和養(yǎng)殖業(yè)都帶來了極大的危害。ETEC的主要毒力因子包括腸毒素、黏附素、志賀毒素、溶血素和內(nèi)毒素等,其中引起腹瀉的主要是具有宿主特異性的黏附素和腸毒素。腸毒素根據(jù)熱穩(wěn)定性分為不耐熱腸毒素（Heat-labile toxin, LT）和耐熱腸毒素（Heat-stable toxin, ST）兩類,現(xiàn)有的檢測方法分別是兔腸袢結扎試驗和乳鼠灌胃試驗,不利于腸毒素的快速檢測。因此,開展腸毒素單克隆抗體和抗原表位的研究,對腸毒素快速檢測方法的建立、致病機理研究和表位疫苗的開發(fā)具有重要的理論和實際意義。本研究以LT為研究對象,開展了LT B亞單位多克隆抗體（PAb）制備、單克隆抗體（MAb）制備和B細胞線性抗原表位的分析。抗LTB多克隆抗體的制備。本研究將質(zhì)粒pET-30a-LTB轉化大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細胞,構建了重組大腸桿菌Rosetta/pET-30a-LTB,誘導表達后獲得了重組蛋白LTB （18... 

【文章來源】：東北農(nóng)業(yè)大學黑龍江省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 致病性大腸桿菌概述
        1.1.1 產(chǎn)志賀毒素性大腸桿菌
        1.1.2 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌
    1.2 不耐熱腸毒素研究進展
        1.2.1 LT的基因與分子結構
        1.2.2 LT的理化特性和受體結合特性
        1.2.3 LT的致病機理
        1.2.4 LT的免疫原性
        1.2.5 LT的黏膜佐劑效應
        1.2.6 LT的檢測方法
    1.3 LTB研究進展
        1.3.1 LTB的免疫調(diào)節(jié)作用
        1.3.2 LTB作為黏膜免疫佐劑的研究
        1.3.3 LTB單克隆抗體研究進展
        1.3.4 LTB抗原表位研究概況
    1.4 研究目的和意義
2 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒、實驗動物及細胞系
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 PCR擴增引物
    2.2 實驗方法
        2.2.1 重組蛋白LTB的表達及鑒定
        2.2.2 多克隆抗體的制備
        2.2.3 單克隆抗體的制備
        2.2.4 單克隆抗體亞類鑒定和效價檢測
        2.2.5 單克隆抗體的免疫原性鑒定
        2.2.6 單克隆抗體的特異性試驗
        2.2.7 單克隆抗體中和活性試驗
        2.2.8 LTB亞單位B細胞線性抗原表位的分析
3 結果與分析
    3.1 重組蛋白LTB的表達及鑒定
        3.1.1 重組質(zhì)粒pET-30a-LTB的鑒定
        3.1.2 重組蛋白LTB的誘導表達及純化
        3.1.3 重組蛋白LTB的鑒定
    3.2 多克隆抗體的制備
    3.3 單克隆抗體的制備
        3.3.1 間接ELISA方法的建立
        3.3.2 雜交瘤細胞的篩選與鑒定
    3.4 單克隆抗體亞類鑒定和效價檢測
        3.4.1 單克隆抗體亞類鑒定
        3.4.2 雜交瘤細胞上清和腹水效價檢測
    3.5 單克隆抗體的免疫原性鑒定
        3.5.1 阻斷ELISA
        3.5.2 Western blot鑒定
    3.6 單克隆抗體的特異性試驗
        3.6.1 Western blot鑒定
        3.6.2 阻斷ELISA
    3.7 單克隆抗體中和活性試驗
        3.7.1 LT對Y1細胞的毒性試驗
        3.7.2 LT對Y1細胞半數(shù)致死量的測定
        3.7.3 單克隆抗體中和滴度的測定
    3.8 LT B亞單位B細胞線性抗原表位的分析
        3.8.1 eltB基因分段克隆
        3.8.2 重組質(zhì)粒的構建與鑒定
        3.8.3 重組短肽的表達
        3.8.4 重組短肽的鑒定
        3.8.5 LT B亞單位B細胞線性抗原表位分析
        3.8.6 單克隆抗體識別的抗原表位分析
4 討論
    4.1 免疫原的制備
    4.2 雜交瘤細胞株建立與篩選
    4.3 雜交瘤細胞的克隆
    4.4 單克隆抗體的應用
    4.5 抗原表位的分析
5 結論
致謝
參考文獻
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]重組大腸桿菌LTB-Stx2B蛋白的表達及其誘導小鼠體液免疫的研究[J]. 李丹丹,趙姝靜,朱穎,韓林林,孟相秋,李金萍,杜元策,呂廣玲,師東方.  中國動物傳染病學報. 2013(05)
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[3]乳酸菌融合表達傳染性法氏囊病毒VP2蛋白與大腸桿菌LTB及其誘導免疫應答的研究[J]. 唐麗杰,張怡婷,喬薪媛,葛俊偉,姜艷萍,崔文,李一經(jīng).  中國預防獸醫(yī)學報. 2012(07)
[4]雞傳染性法氏囊病滅活疫苗免疫雞中和抗體效價與攻毒保護力的相關關系[J]. 李林,景小冬,章振華,鄭小蘭,姜北宇,張建偉.  中國獸醫(yī)科學. 2011(07)
[5]單克隆抗體制備技術及臨床應用的研究進展[J]. 張華,胡成進.  泰山醫(yī)學院學報. 2010(11)
[6]粘膜佐劑LTB優(yōu)化的抗淋病ltB-nspA融合基因疫苗鼻飼免疫效果研究[J]. 王健,胡四海,戴志兵,胡耀華,張愉快,余敏君.  中國免疫學雜志. 2010(11)
[7]分泌抗體的雜交瘤細胞株的制備[J]. 賈建桃,馬海智,李小進,馬麗菊,陳東方,王秦秦.  昆明醫(yī)學院學報. 2009(07)
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博士論文
[1]重組大腸桿菌不耐熱腸毒素及其突變體以及其B亞單位的構建表達與性質(zhì)研究[D]. 馮強.重慶大學 2003

碩士論文
[1]表達大腸桿菌LTAK63與LTB蛋白重組干酪乳桿菌系統(tǒng)的構建及其黏膜佐劑活性的評價[D]. 陳超陽.東北農(nóng)業(yè)大學 2013
[2]大腸桿菌不耐熱腸毒素基因的克隆、改造及表達[D]. 韓冬梅.河北農(nóng)業(yè)大學 2009
[3]共表達豬細小病毒VP2與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位重組乳酸桿菌構建及其免疫學初步評價[D]. 王相清.東北農(nóng)業(yè)大學 2009
[4]大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體的構建及其粘膜免疫劑活性的研究與B亞單位單克隆抗體的制備[D]. 吳麗艷.揚州大學 2008
[5]大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位的克隆、表達、初步純化及免疫活性的研究[D]. 黃思揚.蘭州大學 2006



本文編號：2991728