產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）是引起嬰幼兒和幼畜腹瀉的主要病原體之一,感染者常因劇烈水樣腹瀉和迅速脫水而死亡,給人類的健康和養(yǎng)殖業(yè)都帶來(lái)了極大的危害。ETEC的主要毒力因子包括腸毒素、黏附素、志賀毒素、溶血素和內(nèi)毒素等,其中引起腹瀉的主要是具有宿主特異性的黏附素和腸毒素。腸毒素根據(jù)熱穩(wěn)定性分為不耐熱腸毒素（Heat-labile toxin, LT）和耐熱腸毒素（Heat-stable toxin, ST）兩類,現(xiàn)有的檢測(cè)方法分別是兔腸袢結(jié)扎試驗(yàn)和乳鼠灌胃試驗(yàn),不利于腸毒素的快速檢測(cè)。因此,開展腸毒素單克隆抗體和抗原表位的研究,對(duì)腸毒素快速檢測(cè)方法的建立、致病機(jī)理研究和表位疫苗的開發(fā)具有重要的理論和實(shí)際意義。本研究以LT為研究對(duì)象,開展了LT B亞單位多克隆抗體（PAb）制備、單克隆抗體（MAb）制備和B細(xì)胞線性抗原表位的分析�？筁TB多克隆抗體的制備。本研究將質(zhì)粒pET-30a-LTB轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建了重組大腸桿菌Rosetta/pET-30a-LTB,誘導(dǎo)表達(dá)后獲得了重組蛋白LTB （18... 

【文章來(lái)源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：59 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 致病性大腸桿菌概述
        1.1.1 產(chǎn)志賀毒素性大腸桿菌
        1.1.2 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌
    1.2 不耐熱腸毒素研究進(jìn)展
        1.2.1 LT的基因與分子結(jié)構(gòu)
        1.2.2 LT的理化特性和受體結(jié)合特性
        1.2.3 LT的致病機(jī)理
        1.2.4 LT的免疫原性
        1.2.5 LT的黏膜佐劑效應(yīng)
        1.2.6 LT的檢測(cè)方法
    1.3 LTB研究進(jìn)展
        1.3.1 LTB的免疫調(diào)節(jié)作用
        1.3.2 LTB作為黏膜免疫佐劑的研究
        1.3.3 LTB單克隆抗體研究進(jìn)展
        1.3.4 LTB抗原表位研究概況
    1.4 研究目的和意義
2 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 PCR擴(kuò)增引物
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 重組蛋白LTB的表達(dá)及鑒定
        2.2.2 多克隆抗體的制備
        2.2.3 單克隆抗體的制備
        2.2.4 單克隆抗體亞類鑒定和效價(jià)檢測(cè)
        2.2.5 單克隆抗體的免疫原性鑒定
        2.2.6 單克隆抗體的特異性試驗(yàn)
        2.2.7 單克隆抗體中和活性試驗(yàn)
        2.2.8 LTB亞單位B細(xì)胞線性抗原表位的分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 重組蛋白LTB的表達(dá)及鑒定
        3.1.1 重組質(zhì)粒pET-30a-LTB的鑒定
        3.1.2 重組蛋白LTB的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        3.1.3 重組蛋白LTB的鑒定
    3.2 多克隆抗體的制備
    3.3 單克隆抗體的制備
        3.3.1 間接ELISA方法的建立
        3.3.2 雜交瘤細(xì)胞的篩選與鑒定
    3.4 單克隆抗體亞類鑒定和效價(jià)檢測(cè)
        3.4.1 單克隆抗體亞類鑒定
        3.4.2 雜交瘤細(xì)胞上清和腹水效價(jià)檢測(cè)
    3.5 單克隆抗體的免疫原性鑒定
        3.5.1 阻斷ELISA
        3.5.2 Western blot鑒定
    3.6 單克隆抗體的特異性試驗(yàn)
        3.6.1 Western blot鑒定
        3.6.2 阻斷ELISA
    3.7 單克隆抗體中和活性試驗(yàn)
        3.7.1 LT對(duì)Y1細(xì)胞的毒性試驗(yàn)
        3.7.2 LT對(duì)Y1細(xì)胞半數(shù)致死量的測(cè)定
        3.7.3 單克隆抗體中和滴度的測(cè)定
    3.8 LT B亞單位B細(xì)胞線性抗原表位的分析
        3.8.1 eltB基因分段克隆
        3.8.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
        3.8.3 重組短肽的表達(dá)
        3.8.4 重組短肽的鑒定
        3.8.5 LT B亞單位B細(xì)胞線性抗原表位分析
        3.8.6 單克隆抗體識(shí)別的抗原表位分析
4 討論
    4.1 免疫原的制備
    4.2 雜交瘤細(xì)胞株建立與篩選
    4.3 雜交瘤細(xì)胞的克隆
    4.4 單克隆抗體的應(yīng)用
    4.5 抗原表位的分析
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]重組大腸桿菌LTB-Stx2B蛋白的表達(dá)及其誘導(dǎo)小鼠體液免疫的研究[J]. 李丹丹,趙姝靜,朱穎,韓林林,孟相秋,李金萍,杜元策,呂廣玲,師東方.  中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2013(05)
[2]抗大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位單克隆抗體的制備與鑒定[J]. 陳超陽(yáng),葛俊偉,姜艷平,唐麗杰,喬薪瑗,崔文,李一經(jīng).  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2013(04)
[3]乳酸菌融合表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2蛋白與大腸桿菌LTB及其誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的研究[J]. 唐麗杰,張怡婷,喬薪媛,葛俊偉,姜艷萍,崔文,李一經(jīng).  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012(07)
[4]雞傳染性法氏囊病滅活疫苗免疫雞中和抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)力的相關(guān)關(guān)系[J]. 李林,景小冬,章振華,鄭小蘭,姜北宇,張建偉.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2011(07)
[5]單克隆抗體制備技術(shù)及臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 張華,胡成進(jìn).  泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2010(11)
[6]粘膜佐劑LTB優(yōu)化的抗淋病ltB-nspA融合基因疫苗鼻飼免疫效果研究[J]. 王健,胡四海,戴志兵,胡耀華,張愉快,余敏君.  中國(guó)免疫學(xué)雜志. 2010(11)
[7]分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株的制備[J]. 賈建桃,馬海智,李小進(jìn),馬麗菊,陳東方,王秦秦.  昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2009(07)
[8]噬菌體展示技術(shù)與病毒抗原表位研究[J]. 于永忠,李集臨,徐香玲,于力.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2009(03)
[9]細(xì)菌黏附素研究進(jìn)展[J]. 程寶艷,張丹俊,彭明義,程幫照,戴銀.  畜牧與飼料科學(xué). 2009(02)
[10]大腸桿菌LTb蛋白單克隆抗體的制備和鑒定[J]. 劉煥,王一成,袁秀芳,徐麗華.  浙江農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(05)

博士論文
[1]重組大腸桿菌不耐熱腸毒素及其突變體以及其B亞單位的構(gòu)建表達(dá)與性質(zhì)研究[D]. 馮強(qiáng).重慶大學(xué) 2003

碩士論文
[1]表達(dá)大腸桿菌LTAK63與LTB蛋白重組干酪乳桿菌系統(tǒng)的構(gòu)建及其黏膜佐劑活性的評(píng)價(jià)[D]. 陳超陽(yáng).東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[2]大腸桿菌不耐熱腸毒素基因的克隆、改造及表達(dá)[D]. 韓冬梅.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[3]共表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位重組乳酸桿菌構(gòu)建及其免疫學(xué)初步評(píng)價(jià)[D]. 王相清.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[4]大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體的構(gòu)建及其粘膜免疫劑活性的研究與B亞單位單克隆抗體的制備[D]. 吳麗艷.揚(yáng)州大學(xué) 2008
[5]大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位的克隆、表達(dá)、初步純化及免疫活性的研究[D]. 黃思揚(yáng).蘭州大學(xué) 2006



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