牛輪狀病毒和牛冠狀病毒雙重TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用
發(fā)布時間：2021-01-20 20:55
為建立一種同時檢測牛輪狀病毒（BRV）和牛冠狀病毒（BCV）的方法,本研究根據(jù)GenBank中登錄的BRV VP6基因保守序列和BCV N基因保守序列設(shè)計引物和探針,通過方陣法優(yōu)化體系后,建立了一種可以同時檢測BRV和BCV的雙重TaqMan熒光定量PCR方法。該方法與牛病毒性腹瀉病毒、牛細小病毒、牛腸道病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒均無交叉反應(yīng),特異性強;敏感性試驗結(jié)果顯示,該方法對BRV和BCV重組質(zhì)粒標準品的最低檢測限分別為41.8拷貝/μL和3.55拷貝/μL,敏感性高;組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%,表明該方法重復性較好。利用建立的該方法對本實驗室于2019年3月～9月在河北省內(nèi)采集的72份牛腹瀉糞便樣品進行檢測,結(jié)果顯示BRV的陽性率為50.0%（36/72）,BCV的陽性率為75.0%（54/72）,BRV和BCV共感染率為33.3%（24/72）;而常規(guī)PCR的上述檢測結(jié)果分別為47.2%（34/72）、70.8%（51/72）,共感染率為29.1%（22/72）,二者對BRV和BCV檢測結(jié)果的陽性符合率分別為97.2%、96.8%,表明該方法可以用于臨床樣品的檢測。本研究建...
【文章來源】：中國預防獸醫(yī)學報. 2020,42(10)北大核心
【文章頁數(shù)】：5 頁
【部分圖文】：
熒光定量PCR的特異性試驗結(jié)果
將BRV和BCV重組質(zhì)粒標準品稀釋成1.0×107拷貝/μL～1.0×100拷貝/μL后，經(jīng)雙重Taq Man熒光定量PCR檢測其敏感性。結(jié)果顯示，BRV和BCV的重組質(zhì)粒標準品最低檢測限分別為4.18×101拷貝/μL和3.55×100拷貝/μL（圖4）；而常規(guī)PCR對BRV重組質(zhì)粒標準品最低檢測限為4.18×104拷貝/μL，對BCV重組質(zhì)粒標準品的檢出最低限為3.55×103拷貝/μL（圖5）。表明該方法敏感性優(yōu)于常規(guī)PCR，敏感性較高。2.5 重復性試驗結(jié)果
將BRV和BCV病毒核酸作為模板，利用BRV-F/BRV-R和BCV-F/BCV-R PCR擴增后，分別在116 bp和139 bp出現(xiàn)和預期相符的目的條帶（圖1）。PCR產(chǎn)物純化回收后克隆至p MD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒p MD-BRV和p MD-BCV，測序結(jié)果顯示插入片段與預期一致，表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒標準品。經(jīng)計算p MD-BRV和p MD-BCV的拷貝數(shù)分別為4.36×1010拷貝/μL和3.55×1010拷貝/μL。2.2 雙重熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果及標準曲線的建立
【參考文獻】：
期刊論文
[1]牛輪狀病毒研究進展[J]. 劉占悝,劉澤余,李智杰,郭利. 畜牧獸醫(yī)科學(電子版). 2019(20)
[2]黑龍江省大慶市部分地區(qū)牛輪狀病毒腹瀉的分子流行病學調(diào)查[J]. 賈偉強,胡林杰,孟野,翟海瑞,盛守志,靳廣杰,周玉龍. 畜牧與飼料科學. 2019(05)
[3]若爾蓋縣牦牛輪狀病毒和冠狀病毒感染的血清學監(jiān)測[J]. 澤旺塔,俄么當周,達瓦塔,俄周王么,尚吉措,岳華. 四川畜牧獸醫(yī). 2018(11)
[4]PEDV和TGEV雙重TaqMan熒光定量一步法RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 侯月娥,伍建敏,李中圣. 中國動物傳染病學報. 2017(01)
[5]牛病毒性腹瀉病毒、牛冠狀病毒和牛腸道病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 侯佩莉,王洪梅,何洪彬. 中國獸醫(yī)學報. 2016(10)
[6]BVDV、BCV和BRV三重RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 林初文,沈志強. 畜牧與獸醫(yī). 2013(07)
[7]我國A群牛輪狀病毒感染的血清流行病學調(diào)查[J]. 李鑫,常繼濤,劉海軍,于力. 中國預防獸醫(yī)學報. 2010(09)
[8]犢牛流行性腹瀉病原研究[J]. 宋廣林,董惠蘭,滕慶,楊崢,劉篤冠,王清蘭,段廷樾,孟加敏,秦政. 畜牧獸醫(yī)學報. 1985(02)
碩士論文
[1]寧夏某牛場輪狀病毒的分離鑒定及全基因組序列分析[D]. 葛雨.黑龍江八一農(nóng)墾大學 2019
[2]BRV與BCoV SYBR Green I RT-qPCR檢測方法的建立及應(yīng)用[D]. 曹禹.黑龍江八一農(nóng)墾大學 2018
[3]犢牛冠狀病毒和輪狀病毒間接ELISA診斷方法的建立與初步應(yīng)用[D]. 陸亞冬.石河子大學 2018
本文編號：2989771
【文章來源】：中國預防獸醫(yī)學報. 2020,42(10)北大核心
【文章頁數(shù)】：5 頁
【部分圖文】：
熒光定量PCR的特異性試驗結(jié)果
將BRV和BCV重組質(zhì)粒標準品稀釋成1.0×107拷貝/μL～1.0×100拷貝/μL后，經(jīng)雙重Taq Man熒光定量PCR檢測其敏感性。結(jié)果顯示，BRV和BCV的重組質(zhì)粒標準品最低檢測限分別為4.18×101拷貝/μL和3.55×100拷貝/μL（圖4）；而常規(guī)PCR對BRV重組質(zhì)粒標準品最低檢測限為4.18×104拷貝/μL，對BCV重組質(zhì)粒標準品的檢出最低限為3.55×103拷貝/μL（圖5）。表明該方法敏感性優(yōu)于常規(guī)PCR，敏感性較高。2.5 重復性試驗結(jié)果
將BRV和BCV病毒核酸作為模板，利用BRV-F/BRV-R和BCV-F/BCV-R PCR擴增后，分別在116 bp和139 bp出現(xiàn)和預期相符的目的條帶（圖1）。PCR產(chǎn)物純化回收后克隆至p MD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒p MD-BRV和p MD-BCV，測序結(jié)果顯示插入片段與預期一致，表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒標準品。經(jīng)計算p MD-BRV和p MD-BCV的拷貝數(shù)分別為4.36×1010拷貝/μL和3.55×1010拷貝/μL。2.2 雙重熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果及標準曲線的建立
【參考文獻】：
期刊論文
[1]牛輪狀病毒研究進展[J]. 劉占悝,劉澤余,李智杰,郭利. 畜牧獸醫(yī)科學(電子版). 2019(20)
[2]黑龍江省大慶市部分地區(qū)牛輪狀病毒腹瀉的分子流行病學調(diào)查[J]. 賈偉強,胡林杰,孟野,翟海瑞,盛守志,靳廣杰,周玉龍. 畜牧與飼料科學. 2019(05)
[3]若爾蓋縣牦牛輪狀病毒和冠狀病毒感染的血清學監(jiān)測[J]. 澤旺塔,俄么當周,達瓦塔,俄周王么,尚吉措,岳華. 四川畜牧獸醫(yī). 2018(11)
[4]PEDV和TGEV雙重TaqMan熒光定量一步法RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 侯月娥,伍建敏,李中圣. 中國動物傳染病學報. 2017(01)
[5]牛病毒性腹瀉病毒、牛冠狀病毒和牛腸道病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 侯佩莉,王洪梅,何洪彬. 中國獸醫(yī)學報. 2016(10)
[6]BVDV、BCV和BRV三重RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 林初文,沈志強. 畜牧與獸醫(yī). 2013(07)
[7]我國A群牛輪狀病毒感染的血清流行病學調(diào)查[J]. 李鑫,常繼濤,劉海軍,于力. 中國預防獸醫(yī)學報. 2010(09)
[8]犢牛流行性腹瀉病原研究[J]. 宋廣林,董惠蘭,滕慶,楊崢,劉篤冠,王清蘭,段廷樾,孟加敏,秦政. 畜牧獸醫(yī)學報. 1985(02)
碩士論文
[1]寧夏某牛場輪狀病毒的分離鑒定及全基因組序列分析[D]. 葛雨.黑龍江八一農(nóng)墾大學 2019
[2]BRV與BCoV SYBR Green I RT-qPCR檢測方法的建立及應(yīng)用[D]. 曹禹.黑龍江八一農(nóng)墾大學 2018
[3]犢牛冠狀病毒和輪狀病毒間接ELISA診斷方法的建立與初步應(yīng)用[D]. 陸亞冬.石河子大學 2018
本文編號：2989771
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