為建立一種同時檢測牛輪狀病毒（BRV）和牛冠狀病毒（BCV）的方法,本研究根據GenBank中登錄的BRV VP6基因保守序列和BCV N基因保守序列設計引物和探針,通過方陣法優(yōu)化體系后,建立了一種可以同時檢測BRV和BCV的雙重TaqMan熒光定量PCR方法。該方法與牛病毒性腹瀉病毒、牛細小病毒、牛腸道病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒均無交叉反應,特異性強;敏感性試驗結果顯示,該方法對BRV和BCV重組質粒標準品的最低檢測限分別為41.8拷貝/μL和3.55拷貝/μL,敏感性高;組內和組間變異系數均小于2%,表明該方法重復性較好。利用建立的該方法對本實驗室于2019年3月～9月在河北省內采集的72份牛腹瀉糞便樣品進行檢測,結果顯示BRV的陽性率為50.0%（36/72）,BCV的陽性率為75.0%（54/72）,BRV和BCV共感染率為33.3%（24/72）;而常規(guī)PCR的上述檢測結果分別為47.2%（34/72）、70.8%（51/72）,共感染率為29.1%（22/72）,二者對BRV和BCV檢測結果的陽性符合率分別為97.2%、96.8%,表明該方法可以用于臨床樣品的檢測。本研究建... 

【文章來源】：中國預防獸醫(yī)學報. 2020,42(10)北大核心

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熒光定量PCR的特異性試驗結果

將BRV和BCV重組質粒標準品稀釋成1.0×107拷貝/μL～1.0×100拷貝/μL后，經雙重Taq Man熒光定量PCR檢測其敏感性。結果顯示，BRV和BCV的重組質粒標準品最低檢測限分別為4.18×101拷貝/μL和3.55×100拷貝/μL（圖4）；而常規(guī)PCR對BRV重組質粒標準品最低檢測限為4.18×104拷貝/μL，對BCV重組質粒標準品的檢出最低限為3.55×103拷貝/μL（圖5）。表明該方法敏感性優(yōu)于常規(guī)PCR，敏感性較高。2.5 重復性試驗結果

將BRV和BCV病毒核酸作為模板，利用BRV-F/BRV-R和BCV-F/BCV-R PCR擴增后，分別在116 bp和139 bp出現(xiàn)和預期相符的目的條帶（圖1）。PCR產物純化回收后克隆至p MD19-T載體，構建重組質粒p MD-BRV和p MD-BCV，測序結果顯示插入片段與預期一致，表明正確構建了重組質粒標準品。經計算p MD-BRV和p MD-BCV的拷貝數分別為4.36×1010拷貝/μL和3.55×1010拷貝/μL。2.2 雙重熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化結果及標準曲線的建立

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：2989771