豬圓環(huán)病毒（PCV）根據(jù)血清型可分為豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）。PCV1最早作為一種細(xì)胞污染物而被發(fā)現(xiàn),但是該種病毒在豬身上并不致��；但PCV2目前是一種世界公認(rèn)的重要病原,它可以引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）等多種疾病。PCV2含有2個(gè)主要的開放閱讀框（ORF）:ORF1和ORF2,其中ORF2編碼PCV2唯一的結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白。Cap蛋白由于可以誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答,產(chǎn)生特異性抗體,從而使其成為研究PCV2的免疫機(jī)理和診斷技術(shù)的一個(gè)目標(biāo)。根據(jù)目前已經(jīng)研究報(bào)道顯示,Cap蛋白由233-235個(gè)氨基酸組成,其中包含多個(gè)線性和構(gòu)象抗原表位,其中有部分是和PCV1共有的抗原表位。本研究基于目前的研究報(bào)道對Cap蛋白的抗原表位進(jìn)行鑒定和分析。本研究首先構(gòu)建重組載體pET-Cap,利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Cap蛋白。對已經(jīng)表達(dá)的Cap蛋白與之前實(shí)驗(yàn)室已有的酵母Cap蛋白進(jìn)行反應(yīng)原性比較,酵母表達(dá)的Cap蛋白要好于原核表達(dá)的Cap蛋白。用酵母表達(dá)的Cap蛋白作為抗原對BALB/c雌鼠進(jìn)行免疫制備單克隆抗體獲得3株雜交瘤細(xì)胞株,命名為1E7。4E2、5D1,其中1E... 

【文章來源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 豬圓環(huán)病毒概述
        1.1.1 PCV的基本結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)
        1.1.2 PCV基因分析
        1.1.3 PCV2的分離與復(fù)制
    1.2 PCV2的影響
        1.2.1 PMWS的分布及危害
        1.2.2 PCV2流行病學(xué)特點(diǎn)
        1.2.3 PCV2的傳染路徑
    1.3 PCV2的診斷、預(yù)防與控制
        1.3.1 PCV2的診斷
        1.3.2 PCV2的預(yù)防與控制
    1.4 Cap蛋白免疫原性的研究
    1.5 單克隆抗體的研究進(jìn)展
        1.5.1 單克隆抗體的相關(guān)研究
        1.5.2 抗原表位的鑒定
    1.6 PCV2的表位分析
    1.7 研究的意義
2 材料與方法
    2.1 PCV2 Cap蛋白的原核表達(dá)和抗原性比較
        2.1.1 病毒、細(xì)胞、質(zhì)粒載體和菌株
        2.1.2 主要試劑和儀器
        2.1.3 引物設(shè)計(jì)
        2.1.4 PCV2 Cap蛋白基因的擴(kuò)增與鑒定
        2.1.5 PCV2 Cap蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.1.6 Cap蛋白原核表達(dá)及SDS-PAGE分析
        2.1.7 原核表達(dá)Cap蛋白純化
        2.1.8 原核表達(dá)與真核表達(dá)Cap蛋白的反應(yīng)原性比較
    2.2 PCV2 Cap蛋白單克隆抗體的制備和鑒定
        2.2.1 主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞和試劑
        2.2.2 主要試劑的配制
        2.2.3 動(dòng)物免疫
        2.2.4 間接ELISA方法的建立
        2.2.5 細(xì)胞融合
        2.2.6 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選與培養(yǎng)
        2.2.7 單克隆抗體特性鑒定
        2.2.8 腹水的制備與純化
        2.2.9 上清與腹水效價(jià)的檢測
    2.3 PCV2 Cap蛋白抗原表位鑒定
        2.3.1 主要質(zhì)粒和菌株
        2.3.2 Cap蛋白的截短表達(dá)
        2.3.3 Cap蛋白抗原表位的鑒定
        2.3.4 Cap蛋白抗原表位空間位置分析
3 結(jié)果
    3.1 PCV2 Cap蛋白原核表達(dá)結(jié)果鑒定
        3.1.1 Cap蛋白基因PCR擴(kuò)增
        3.1.2 重組質(zhì)粒pET-Cap的酶切鑒定
        3.1.3 Cap蛋白的SDS-PAGE分析
        3.1.4 Cap蛋白原核表達(dá)與真核表達(dá)的比較
    3.2 PCV2 Cap蛋白單克隆抗體的制備
        3.2.1 間接ELISA方法的確立
        3.2.2 陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選
        3.2.3 單克隆抗體分泌的穩(wěn)定性檢測
        3.2.4 單克隆抗體亞型的鑒定
        3.2.5 單克隆抗體的Western blot鑒定
        3.2.6 單克隆抗體的IFA鑒定
        3.2.7 純化腹水的SDS-PAGE分析
        3.2.8 腹水的效價(jià)分析
    3.3 Cap蛋白截短表達(dá)結(jié)果鑒定
        3.3.1 重組載體酶切鑒定
        3.3.2 重組載體菌液PCR擴(kuò)增鑒定
        3.3.3 截短蛋白SDS-PAGE分析
    3.4 Cap蛋白抗原表位鑒定
        3.4.1 Cap蛋白抗原表位初步鑒定
        3.4.2 Cap蛋白抗原表位精確鑒定
    3.5 Cap蛋白抗原表位圖譜繪制分析
4 討論
    4.1 Cap蛋白的原核表達(dá)與酵母表達(dá)的比較
    4.2 Cap蛋白的單克隆抗體制備和鑒定
    4.3 Cap蛋白的抗原表位鑒定
    4.4 Cap蛋白的抗原表位圖譜繪制分析
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[8]單克隆抗體制劑的最新進(jìn)展[J]. 霍晨敏,朱昀,孫進(jìn)偉,吳立柱,沈銀柱,黃占景.  河北師范大學(xué)學(xué)報(bào). 2004(05)
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碩士論文
[1]豬圓環(huán)病毒2型ORF2截短基因的原核表達(dá)及其單克隆抗體的研制和應(yīng)用[D]. 馬攀攀.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[2]豬圓環(huán)病毒1型和2型血清抗體鑒別診斷技術(shù)的研究[D]. 黃立平.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2009



本文編號(hào)：2988669