奶山羊是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，具有生產(chǎn)肉、奶等經(jīng)濟(jì)價(jià)值，利用奶山羊乳腺作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物藥制品具有巨大的應(yīng)用前景。采用雄性生殖干細(xì)胞作為種子細(xì)胞開展奶山羊的遺傳育種以及轉(zhuǎn)基因的研究是目前的研究熱點(diǎn)。雄性生殖干細(xì)胞負(fù)責(zé)成年雄性個(gè)體的精子生產(chǎn)；在體外適宜培養(yǎng)條件下，其可形成類似胚胎干細(xì)胞樣的多能干細(xì)胞。CD49f已經(jīng)被證實(shí)是人和小鼠雄性生殖干細(xì)胞的有效標(biāo)記，與細(xì)胞的多能性關(guān)系密切。miR-302能調(diào)控細(xì)胞的多能性，具有重編程人體細(xì)胞至多能干細(xì)胞的潛能。一直以來，有關(guān)家畜雄性生殖干細(xì)胞體外培養(yǎng)形成多能干細(xì)胞的機(jī)制的研究進(jìn)展較緩慢。本試驗(yàn)探索了CD49f作為奶山羊雄性生殖干細(xì)胞分離、鑒定標(biāo)記的有效性；優(yōu)化了奶山羊雄性生殖干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系；體外培養(yǎng)比較CD49f陰、陽性細(xì)胞的生物學(xué)功能差異；體外轉(zhuǎn)導(dǎo)永生化基因至奶山羊雄性生殖干細(xì)胞，探索奶山羊雄性生殖干細(xì)胞永生化的可能性及其生物學(xué)特性；轉(zhuǎn)導(dǎo)miR-302至永生化的奶山羊雄性生殖干細(xì)胞，探索miR-302對(duì)奶山羊雄性生殖干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響；結(jié)合前人的研究結(jié)果，嘗試解析CD49f和miR-302調(diào)節(jié)奶山羊mGSCs生物學(xué)特性的機(jī)制。研究結(jié)果如下... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻(xiàn)綜述
    第一章 雄性生殖干細(xì)胞及 CD49f 研究進(jìn)展
        1.1 雄性生殖干細(xì)胞的研究進(jìn)展
            1.1.1 精原干細(xì)胞的起源
            1.1.2 生精周期
            1.1.3 生殖系發(fā)育
            1.1.4 MGSCs 的移植
            1.1.5 mGSCs 的分子標(biāo)記及純化
            1.1.6 mGSCs 微環(huán)境
            1.1.7 mGSCs 培養(yǎng)
            1.1.8 mGSCs 研究存在的問題
        1.2 CD49f 的研究進(jìn)展
    第二章 MiR-302 及多能性干細(xì)胞研究進(jìn)展
        2.1 MiR-302/367 研究進(jìn)展
            2.1.1 MiR-302 的發(fā)現(xiàn)
            2.1.2 MiR-302 的結(jié)構(gòu)
            2.1.3 MiR-302/367 在多能性細(xì)胞中的作用
            2.1.4 MiR-302/367 對(duì)體細(xì)胞重編程的作用
            2.1.5 miR-302/367 的靶基因
            2.1.6 miR-302/367 研究的前景
        2.2 多能干細(xì)胞研究進(jìn)展
            2.2.1 多能性維持的核心因子
            2.2.2 多能性相關(guān)的信號(hào)通路
            2.2.3 P53
            2.2.4 多能干細(xì)胞的研究前景
試驗(yàn)部分
    第三章 CD49f 可以作為奶山羊 mGSCs 鑒定和富集的有效標(biāo)記
        3.1 實(shí)驗(yàn)材料
            3.1.1 組織樣品
            3.1.2 主要試劑
        3.2 方法
            3.2.1 CD49f 分子的遺傳同源性分析
            3.2.2 組織切片的免疫熒光分析
            3.2.3 小鼠胚胎成纖維（Mouse embryonic fibroblast, MEF）飼養(yǎng)層的制備
            3.2.4 分離奶山羊睪丸單細(xì)胞懸液
            3.2.5 利用 CD49f 抗體分選奶山羊睪丸細(xì)胞
            3.2.6 分選所得細(xì)胞的后續(xù)培養(yǎng)
            3.2.7 細(xì)胞免疫熒光染色分析
            3.2.8 總 RNA 的提取及 PCR 檢測基因表達(dá)
            3.2.9 統(tǒng)計(jì)分析
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 CD49f 序列的遺傳分析
            3.3.2 CD49f 在奶山羊睪丸中的定位
            3.3.3 CD49f 的表達(dá)水平及表達(dá)特異性的鑒定
            3.3.4 CD49f 分選奶山羊睪丸細(xì)胞
            3.3.5 體外培養(yǎng)后 CD49f 陰、陽性細(xì)胞的鑒定
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 奶山羊 mGSCs 培養(yǎng)條件的篩選
        4.1 材料
            4.1.1 奶山羊睪丸組織
            4.1.2 培養(yǎng)基配方
            4.1.3 主要試劑
        4.2 方法
            4.2.1 奶山羊 mGSCs 的分離及富集
            4.2.2 比較 N2B27 和去分化培養(yǎng)基培養(yǎng)奶山羊 mGSCs 的效果
            4.2.3 比較 N2B27 與經(jīng)典的 SSC 培養(yǎng)基培養(yǎng)奶山羊 mGSCs 的效果
            4.2.4 不同細(xì)胞外基質(zhì)培養(yǎng)奶山羊 mGSCs
            4.2.5 AP 染色
            4.2.6 其他試驗(yàn)方法
            4.2.7 統(tǒng)計(jì)分析
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 N2B27 培養(yǎng)液比去分化培養(yǎng)液更能促進(jìn)奶山羊 mGSCs 的培養(yǎng)
            4.3.2 N2B27 培養(yǎng)液與經(jīng)典的 SSC 培養(yǎng)液培養(yǎng)奶山羊 mGSCs 的效果比對(duì)
            4.3.3 不同細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)奶山羊 mGSCs 體外培養(yǎng)的影響
            4.3.4 探索 P53 對(duì)奶山羊 mGSCs 體外無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的影響
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
    第五章 CD49f 陰、陽性細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性研究
        5.1 材料
            5.1.1 奶山羊睪丸組織
            5.1.2 酶類及其他相關(guān)試劑
            5.1.3 主要儀器及耗材
        5.2 方法
            5.2.1 CD49f 陰、陽性細(xì)胞的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)
            5.2.2 CD49f 陰、陽性細(xì)胞體外誘導(dǎo)形成單倍體細(xì)胞
            5.2.3 總 RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄及 QPCR
            5.2.4 細(xì)胞免疫熒光染色
            5.2.5 統(tǒng)計(jì)分析
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 CD49f 陰、陽性精原細(xì)胞培養(yǎng)于體外無飼養(yǎng)層條件下的差異
            5.3.2 體外誘導(dǎo)分化 CD49f 陰、陽性細(xì)胞形成單倍體細(xì)胞的能力檢測
            5.3.3 QPCR 檢測 CD49f 陰、陽性細(xì)胞的差異
            5.3.4 免疫熒光染色檢測 CD49f 陰、陽性細(xì)胞的差異
        5.4 討論
        5.5 小結(jié)
    第六章 奶山羊 mGSCs 的永生化及 miR-302 對(duì)永生化 mGSCs 的影響
        6.1 材料
            6.1.1 動(dòng)物材料
            6.1.2 主要試劑
        6.2 方法
            6.2.1 分離、富集奶山羊 mGSCs
            6.2.2 慢病毒包裝及奶山羊 mGSCs 的永生化
            6.2.3 細(xì)胞周期分析
            6.2.4 細(xì)胞群體倍增時(shí)間分析（Population doubling time, PDT）
            6.2.5 5-Bromo-2-deoxyuridine （BrdU）摻入分析
            6.2.6 細(xì)胞生長曲線分析
            6.2.7 永生化奶山羊 mGSCs 外源性基因分析
            6.2.8 RT-PCR
            6.2.9 免疫熒光染色
            6.2.10 永生化的奶山羊 mGSCs 體外分化能力檢測
            6.2.11 永生化的奶山羊 mGSCs 的體內(nèi)分化能力檢測
            6.2.12 移植永生化的奶山羊 mGSCs 到生精缺陷的受體小鼠睪丸中檢測其 mGSCs特性
            6.2.13 熒光原位雜交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）檢測 miR-302 及其與CD49f 與 CD90 的共定位
            6.2.14 統(tǒng)計(jì)分析
        6.3 結(jié)果
            6.3.1 奶山羊 mGSCs 永生化后細(xì)胞增殖能力的改變
            6.3.2 永生化前后奶山羊 mGSCs 細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)的檢測
            6.3.3 永生化之后奶山羊 mGSCs 的體外分化能力檢測
            6.3.4 永生化奶山羊 mGSCs 的體內(nèi)分化能力檢測
            6.3.5 永生化奶山羊 mGSCs 移植檢測生殖干細(xì)胞功能
            6.3.6 永生化奶山羊 mGSCs 精子細(xì)胞分化功能的檢測
            6.3.7 MiR-302 在奶山羊睪丸中的定位檢測
            6.3.8 MiR-302 對(duì)奶山羊 mGSCs 生物學(xué)特性的影響
        6.4 討論
        6.5 小結(jié)
    第七章 CD49f 及 miR-302 影響奶山羊 mGSCs 的機(jī)理探索
        7.1 材料
            7.1.1 細(xì)胞
            7.1.2 主要試劑
        7.2 方法
            7.2.1 PI3K 信號(hào)通路在奶山羊雄性生殖干細(xì)胞中的作用的驗(yàn)證
            7.2.2 CD49f 相關(guān)分子的尋找及驗(yàn)證
            7.2.3 Western blot
            7.2.4 miR-302 相關(guān)分子機(jī)制的解析
            7.2.5 統(tǒng)計(jì)分析
        7.3 結(jié)果
            7.3.1 CD49f 陽性細(xì)胞中 PI3K 信號(hào)通路的驗(yàn)證
            7.2.2 CD49f 影響奶山羊 mGSCs 凋亡、多能性的分子機(jī)制
            7.2.3 miR-302 影響奶山羊 mGSCs 細(xì)胞貼壁、凋亡及多能性的分子機(jī)制
        7.4 討論
        7.5 小結(jié)
全文結(jié)論
創(chuàng)新之處和進(jìn)一步研究的課題
參考文獻(xiàn)
附錄
附表
致謝
個(gè)人簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]12個(gè)物種miR-302基因簇的生物信息學(xué)分析[J]. 崔亞茹,張坤山,羅玉萍,李思光.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2011(03)
[2]Isolation of Subtype Spermatogonia in Juvenile Rats[J]. 白楊,葉哲偉,曾甫清.  Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences）. 2008(04)
[3]人精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其功能鑒定[J]. 李彥鋒,郭應(yīng)祿,李曉紅,靳鳳爍,孫中義.  中華男科學(xué)雜志. 2005(12)



本文編號(hào)：2987761