奶山羊是重要的經濟動物，具有生產肉、奶等經濟價值，利用奶山羊乳腺作為生物反應器生產生物藥制品具有巨大的應用前景。采用雄性生殖干細胞作為種子細胞開展奶山羊的遺傳育種以及轉基因的研究是目前的研究熱點。雄性生殖干細胞負責成年雄性個體的精子生產；在體外適宜培養(yǎng)條件下，其可形成類似胚胎干細胞樣的多能干細胞。CD49f已經被證實是人和小鼠雄性生殖干細胞的有效標記，與細胞的多能性關系密切。miR-302能調控細胞的多能性，具有重編程人體細胞至多能干細胞的潛能。一直以來，有關家畜雄性生殖干細胞體外培養(yǎng)形成多能干細胞的機制的研究進展較緩慢。本試驗探索了CD49f作為奶山羊雄性生殖干細胞分離、鑒定標記的有效性；優(yōu)化了奶山羊雄性生殖干細胞的體外培養(yǎng)體系；體外培養(yǎng)比較CD49f陰、陽性細胞的生物學功能差異；體外轉導永生化基因至奶山羊雄性生殖干細胞，探索奶山羊雄性生殖干細胞永生化的可能性及其生物學特性；轉導miR-302至永生化的奶山羊雄性生殖干細胞，探索miR-302對奶山羊雄性生殖干細胞生物學特性的影響；結合前人的研究結果，嘗試解析CD49f和miR-302調節(jié)奶山羊mGSCs生物學特性的機制。研究結果如下... 

【文章來源】：西北農林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：119 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻綜述
    第一章 雄性生殖干細胞及 CD49f 研究進展
        1.1 雄性生殖干細胞的研究進展
            1.1.1 精原干細胞的起源
            1.1.2 生精周期
            1.1.3 生殖系發(fā)育
            1.1.4 MGSCs 的移植
            1.1.5 mGSCs 的分子標記及純化
            1.1.6 mGSCs 微環(huán)境
            1.1.7 mGSCs 培養(yǎng)
            1.1.8 mGSCs 研究存在的問題
        1.2 CD49f 的研究進展
    第二章 MiR-302 及多能性干細胞研究進展
        2.1 MiR-302/367 研究進展
            2.1.1 MiR-302 的發(fā)現(xiàn)
            2.1.2 MiR-302 的結構
            2.1.3 MiR-302/367 在多能性細胞中的作用
            2.1.4 MiR-302/367 對體細胞重編程的作用
            2.1.5 miR-302/367 的靶基因
            2.1.6 miR-302/367 研究的前景
        2.2 多能干細胞研究進展
            2.2.1 多能性維持的核心因子
            2.2.2 多能性相關的信號通路
            2.2.3 P53
            2.2.4 多能干細胞的研究前景
試驗部分
    第三章 CD49f 可以作為奶山羊 mGSCs 鑒定和富集的有效標記
        3.1 實驗材料
            3.1.1 組織樣品
            3.1.2 主要試劑
        3.2 方法
            3.2.1 CD49f 分子的遺傳同源性分析
            3.2.2 組織切片的免疫熒光分析
            3.2.3 小鼠胚胎成纖維（Mouse embryonic fibroblast, MEF）飼養(yǎng)層的制備
            3.2.4 分離奶山羊睪丸單細胞懸液
            3.2.5 利用 CD49f 抗體分選奶山羊睪丸細胞
            3.2.6 分選所得細胞的后續(xù)培養(yǎng)
            3.2.7 細胞免疫熒光染色分析
            3.2.8 總 RNA 的提取及 PCR 檢測基因表達
            3.2.9 統(tǒng)計分析
        3.3 結果
            3.3.1 CD49f 序列的遺傳分析
            3.3.2 CD49f 在奶山羊睪丸中的定位
            3.3.3 CD49f 的表達水平及表達特異性的鑒定
            3.3.4 CD49f 分選奶山羊睪丸細胞
            3.3.5 體外培養(yǎng)后 CD49f 陰、陽性細胞的鑒定
        3.4 討論
        3.5 小結
    第四章 奶山羊 mGSCs 培養(yǎng)條件的篩選
        4.1 材料
            4.1.1 奶山羊睪丸組織
            4.1.2 培養(yǎng)基配方
            4.1.3 主要試劑
        4.2 方法
            4.2.1 奶山羊 mGSCs 的分離及富集
            4.2.2 比較 N2B27 和去分化培養(yǎng)基培養(yǎng)奶山羊 mGSCs 的效果
            4.2.3 比較 N2B27 與經典的 SSC 培養(yǎng)基培養(yǎng)奶山羊 mGSCs 的效果
            4.2.4 不同細胞外基質培養(yǎng)奶山羊 mGSCs
            4.2.5 AP 染色
            4.2.6 其他試驗方法
            4.2.7 統(tǒng)計分析
        4.3 結果
            4.3.1 N2B27 培養(yǎng)液比去分化培養(yǎng)液更能促進奶山羊 mGSCs 的培養(yǎng)
            4.3.2 N2B27 培養(yǎng)液與經典的 SSC 培養(yǎng)液培養(yǎng)奶山羊 mGSCs 的效果比對
            4.3.3 不同細胞外基質對奶山羊 mGSCs 體外培養(yǎng)的影響
            4.3.4 探索 P53 對奶山羊 mGSCs 體外無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的影響
        4.4 討論
        4.5 小結
    第五章 CD49f 陰、陽性細胞體外培養(yǎng)的生物學特性研究
        5.1 材料
            5.1.1 奶山羊睪丸組織
            5.1.2 酶類及其他相關試劑
            5.1.3 主要儀器及耗材
        5.2 方法
            5.2.1 CD49f 陰、陽性細胞的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)
            5.2.2 CD49f 陰、陽性細胞體外誘導形成單倍體細胞
            5.2.3 總 RNA 提取、反轉錄及 QPCR
            5.2.4 細胞免疫熒光染色
            5.2.5 統(tǒng)計分析
        5.3 結果
            5.3.1 CD49f 陰、陽性精原細胞培養(yǎng)于體外無飼養(yǎng)層條件下的差異
            5.3.2 體外誘導分化 CD49f 陰、陽性細胞形成單倍體細胞的能力檢測
            5.3.3 QPCR 檢測 CD49f 陰、陽性細胞的差異
            5.3.4 免疫熒光染色檢測 CD49f 陰、陽性細胞的差異
        5.4 討論
        5.5 小結
    第六章 奶山羊 mGSCs 的永生化及 miR-302 對永生化 mGSCs 的影響
        6.1 材料
            6.1.1 動物材料
            6.1.2 主要試劑
        6.2 方法
            6.2.1 分離、富集奶山羊 mGSCs
            6.2.2 慢病毒包裝及奶山羊 mGSCs 的永生化
            6.2.3 細胞周期分析
            6.2.4 細胞群體倍增時間分析（Population doubling time, PDT）
            6.2.5 5-Bromo-2-deoxyuridine （BrdU）摻入分析
            6.2.6 細胞生長曲線分析
            6.2.7 永生化奶山羊 mGSCs 外源性基因分析
            6.2.8 RT-PCR
            6.2.9 免疫熒光染色
            6.2.10 永生化的奶山羊 mGSCs 體外分化能力檢測
            6.2.11 永生化的奶山羊 mGSCs 的體內分化能力檢測
            6.2.12 移植永生化的奶山羊 mGSCs 到生精缺陷的受體小鼠睪丸中檢測其 mGSCs特性
            6.2.13 熒光原位雜交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）檢測 miR-302 及其與CD49f 與 CD90 的共定位
            6.2.14 統(tǒng)計分析
        6.3 結果
            6.3.1 奶山羊 mGSCs 永生化后細胞增殖能力的改變
            6.3.2 永生化前后奶山羊 mGSCs 細胞形態(tài)變化及細胞標記表達的檢測
            6.3.3 永生化之后奶山羊 mGSCs 的體外分化能力檢測
            6.3.4 永生化奶山羊 mGSCs 的體內分化能力檢測
            6.3.5 永生化奶山羊 mGSCs 移植檢測生殖干細胞功能
            6.3.6 永生化奶山羊 mGSCs 精子細胞分化功能的檢測
            6.3.7 MiR-302 在奶山羊睪丸中的定位檢測
            6.3.8 MiR-302 對奶山羊 mGSCs 生物學特性的影響
        6.4 討論
        6.5 小結
    第七章 CD49f 及 miR-302 影響奶山羊 mGSCs 的機理探索
        7.1 材料
            7.1.1 細胞
            7.1.2 主要試劑
        7.2 方法
            7.2.1 PI3K 信號通路在奶山羊雄性生殖干細胞中的作用的驗證
            7.2.2 CD49f 相關分子的尋找及驗證
            7.2.3 Western blot
            7.2.4 miR-302 相關分子機制的解析
            7.2.5 統(tǒng)計分析
        7.3 結果
            7.3.1 CD49f 陽性細胞中 PI3K 信號通路的驗證
            7.2.2 CD49f 影響奶山羊 mGSCs 凋亡、多能性的分子機制
            7.2.3 miR-302 影響奶山羊 mGSCs 細胞貼壁、凋亡及多能性的分子機制
        7.4 討論
        7.5 小結
全文結論
創(chuàng)新之處和進一步研究的課題
參考文獻
附錄
附表
致謝
個人簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]12個物種miR-302基因簇的生物信息學分析[J]. 崔亞茹,張坤山,羅玉萍,李思光.  基因組學與應用生物學. 2011(03)
[2]Isolation of Subtype Spermatogonia in Juvenile Rats[J]. 白楊,葉哲偉,曾甫清.  Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences）. 2008(04)
[3]人精原干細胞的體外培養(yǎng)及其功能鑒定[J]. 李彥鋒,郭應祿,李曉紅,靳鳳爍,孫中義.  中華男科學雜志. 2005(12)



本文編號：2987761