弓形蟲致密顆粒蛋白1（GRA1）的生物學(xué)功能研究
發(fā)布時(shí)間：2021-01-17 06:05
剛地弓形蟲是一類嚴(yán)格的胞內(nèi)寄生原蟲,呈全世界分布,可感染哺乳動(dòng)物,鳥類,甚至冷血?jiǎng)游?弓形蟲有如此廣泛的宿主,除了與它強(qiáng)大的入侵機(jī)制有關(guān)之外,還和它強(qiáng)大的免疫逃避機(jī)制和適應(yīng)并改變宿主細(xì)胞環(huán)境的能力有著密切的關(guān)系。這也是導(dǎo)致弓形蟲病難以防控的主要原因。弓形蟲致密顆粒蛋白GRA16、GRA24、TgIST可利用宿主細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)入宿主細(xì)胞核,調(diào)控宿主細(xì)胞表達(dá),改變宿主細(xì)胞的免疫狀態(tài)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,以實(shí)現(xiàn)免疫逃避和長(zhǎng)期寄生。致密顆粒蛋白GRA17和GRA23可在納蟲泡膜上形成微孔,該孔可幫助弓形蟲攝取宿主營(yíng)養(yǎng),致密顆粒蛋白MAF1、GRA3和GRA5參與弓形蟲對(duì)宿主細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的招募,幫助弓形蟲利用宿主營(yíng)養(yǎng)�？梢哉f(shuō),致密顆粒蛋白對(duì)于弓形蟲胞內(nèi)寄生十分重要。GRA1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的致密顆粒蛋白,但關(guān)于它的生物學(xué)功能我們知之甚少,研究它的生物學(xué)功能可以為進(jìn)一步理解弓形蟲胞內(nèi)寄生的特性提供幫助,為以后的弓形蟲研究奠定理論基礎(chǔ)。本研究以弓形蟲致密顆粒蛋白1（TgGRA1）為研究對(duì)象,利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)（Tet-off）對(duì)TATi蟲株中的GRA1進(jìn)行條件性敲除,...
【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
弓形蟲生活史[49]
圖 1-2 BioID 技術(shù)模式圖[83]Fig.1-2 Model for application of BioID method[83]術(shù)的特點(diǎn)是對(duì)真核細(xì)胞自然環(huán)境中對(duì)目標(biāo)蛋白的鄰近蛋白進(jìn)行而這些鄰近蛋白很有可能就是與目標(biāo)蛋白有潛在性互作的蛋白，對(duì)篩選到的鄰近蛋白進(jìn)行定性分析[83]。BirA*是由BirA突變而來(lái)于大腸桿菌的具有35kDa大小的DNA結(jié)合生物素蛋白連接酶。它輔酶A羧化酶的生物素化，同時(shí)也作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子生物素合。但是BirA的生物素化范圍具有極高的特異性，能夠被其識(shí)別并須擁有一個(gè)生物素受體標(biāo)簽(BAT)[83]。為了提高BirA的生物素化序列中的118位精氨酸突變?yōu)楦拾彼�，如此，BirA*突變體的生物高[83]。素標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用組裝的精確特征描述是理解功能性蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的先決條件，Bio用于解決這個(gè)問(wèn)題[82]。BioID 已經(jīng)成功的篩選到哺乳動(dòng)物核纖層胞骨架結(jié)構(gòu)[84]，一些聯(lián)系緊密的亞細(xì)胞蛋白組[85]，還發(fā)現(xiàn)了一種
弓形蟲致密顆粒蛋白 1（GRA1）的生物學(xué)功能研究m 電轉(zhuǎn)杯中按 1:5 比例加入同源片段和 CRISPR 質(zhì)粒，混1) 中的蟲體懸液加入電轉(zhuǎn)杯中，混勻進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條 μF，50 Ω，電擊 2~3 次，電轉(zhuǎn)后的蟲體在 HFF 細(xì)胞中未經(jīng)電轉(zhuǎn)處理的蟲體作為對(duì)照組；4 小時(shí)之后對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行換液，加入含有霉酚度分別為 25 ug/ml、50 ug/ml 的培養(yǎng)基，藥物篩選 2~30%蟲體逸出，細(xì)胞內(nèi)納蟲泡比較大，按照 3.3.1 的方法中培養(yǎng)基需加入霉酚酸和黃嘌呤，直至空白對(duì)照的蟲體制稀釋法在長(zhǎng)滿 HFF 細(xì)胞的 96 孔板中進(jìn)行單克隆篩篩選獲得的單克隆接種到長(zhǎng)滿 HFF 細(xì)胞的 24 孔板中 PCRs 對(duì)所有單克隆進(jìn)行初步鑒定。初步鑒定正確的 T25 中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行再鑒定，最終鑒定正確的蟲鑒定 PCRs 包括 PCR1、PCR2、PCR3，鑒定方法及鑒
本文編號(hào)：2982339
【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
弓形蟲生活史[49]
圖 1-2 BioID 技術(shù)模式圖[83]Fig.1-2 Model for application of BioID method[83]術(shù)的特點(diǎn)是對(duì)真核細(xì)胞自然環(huán)境中對(duì)目標(biāo)蛋白的鄰近蛋白進(jìn)行而這些鄰近蛋白很有可能就是與目標(biāo)蛋白有潛在性互作的蛋白，對(duì)篩選到的鄰近蛋白進(jìn)行定性分析[83]。BirA*是由BirA突變而來(lái)于大腸桿菌的具有35kDa大小的DNA結(jié)合生物素蛋白連接酶。它輔酶A羧化酶的生物素化，同時(shí)也作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子生物素合。但是BirA的生物素化范圍具有極高的特異性，能夠被其識(shí)別并須擁有一個(gè)生物素受體標(biāo)簽(BAT)[83]。為了提高BirA的生物素化序列中的118位精氨酸突變?yōu)楦拾彼�，如此，BirA*突變體的生物高[83]。素標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用組裝的精確特征描述是理解功能性蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的先決條件，Bio用于解決這個(gè)問(wèn)題[82]。BioID 已經(jīng)成功的篩選到哺乳動(dòng)物核纖層胞骨架結(jié)構(gòu)[84]，一些聯(lián)系緊密的亞細(xì)胞蛋白組[85]，還發(fā)現(xiàn)了一種
弓形蟲致密顆粒蛋白 1（GRA1）的生物學(xué)功能研究m 電轉(zhuǎn)杯中按 1:5 比例加入同源片段和 CRISPR 質(zhì)粒，混1) 中的蟲體懸液加入電轉(zhuǎn)杯中，混勻進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條 μF，50 Ω，電擊 2~3 次，電轉(zhuǎn)后的蟲體在 HFF 細(xì)胞中未經(jīng)電轉(zhuǎn)處理的蟲體作為對(duì)照組；4 小時(shí)之后對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行換液，加入含有霉酚度分別為 25 ug/ml、50 ug/ml 的培養(yǎng)基，藥物篩選 2~30%蟲體逸出，細(xì)胞內(nèi)納蟲泡比較大，按照 3.3.1 的方法中培養(yǎng)基需加入霉酚酸和黃嘌呤，直至空白對(duì)照的蟲體制稀釋法在長(zhǎng)滿 HFF 細(xì)胞的 96 孔板中進(jìn)行單克隆篩篩選獲得的單克隆接種到長(zhǎng)滿 HFF 細(xì)胞的 24 孔板中 PCRs 對(duì)所有單克隆進(jìn)行初步鑒定。初步鑒定正確的 T25 中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行再鑒定，最終鑒定正確的蟲鑒定 PCRs 包括 PCR1、PCR2、PCR3，鑒定方法及鑒
本文編號(hào)：2982339
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