動(dòng)物病毒感染、復(fù)制以及致病等過程都離不開宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)參與,宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)可能在病毒感染過程中抑制病毒的生命活動(dòng),限制甚至清除病毒感染,也可能被病毒利用,為病毒的繁殖等提供便利。親環(huán)素A （CypA）是一種保守性極強(qiáng)的伴侶蛋白,廣泛分布于動(dòng)物與微生物體內(nèi),哺乳動(dòng)物的親環(huán)素A大多與疾病相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在探索豬CypA在豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）復(fù)制過程中的作用,就豬CypA對(duì)TGEV體外復(fù)制的影響進(jìn)行以下研究：1.TGEV四川株的分離鑒定與熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立利用PK-15細(xì)胞從四川腹瀉仔豬樣品中分離得到一株病毒,經(jīng)PCR檢測(cè)、病毒理化實(shí)驗(yàn)與微量中和實(shí)驗(yàn)證實(shí)該分離株為TGEV,命名為SC-T。根據(jù)TGEV的S基因設(shè)計(jì)合成一對(duì)熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物,建立TGEV SYBR Green熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒繪制熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行該檢測(cè)方法的特異性、重復(fù)性、靈敏性實(shí)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度在5.32×107～5.32×101copies/μL時(shí)可以得到較理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線,該方法重復(fù)性與特異性好,可檢測(cè)最低濃度為5copies/μL。2.豬CypA的... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：75 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    1 豬傳染性胃腸炎研究進(jìn)展
        1.1 病原學(xué)
        1.2 豬傳染性胃腸炎流行病學(xué)
        1.3 豬傳染性胃腸炎致病機(jī)制
        1.4 豬傳染性胃腸炎診斷
            1.4.1 病毒的分離與鑒定
            1.4.2 血清學(xué)檢測(cè)
            1.4.3 豬傳染性胃腸炎病毒分子檢測(cè)
        1.5 豬傳染性胃腸炎疫苗與免疫預(yù)防
    2 親環(huán)素A研究進(jìn)展
        2.1 親環(huán)素A的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能
        2.2 親環(huán)素A在病毒感染中的作用
            2.2.1 CypA與艾滋病毒的相互作用
            2.2.2 Cyclophilin A與流感病毒的相互作用
            2.2.3 Cyclophilin A與其他病毒的相互作用
目的與意義
第二部分 實(shí)驗(yàn)部分
    第一章 豬傳染性胃腸炎病毒分離鑒定與熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.2 菌株與細(xì)胞
            1.3 實(shí)驗(yàn)器材
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 病毒分離
            2.2 病毒PCR檢測(cè)
                2.2.1 病毒液總RNA提取
                2.2.2 反轉(zhuǎn)錄制備cDNA
                2.2.3 TGEV PCR檢測(cè)
                2.2.4 其他病毒病原PCR檢測(cè)
            2.3 病毒TCID50測(cè)定
            2.4 病毒中和實(shí)驗(yàn)
            2.5 病毒理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)
                2.5.1 病毒核酸類型測(cè)定
                2.5.2 氯仿實(shí)驗(yàn)
            2.6 豬傳染性胃腸炎病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立
                2.6.1 熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物設(shè)計(jì)
                2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建
                2.6.3 TGEV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
                2.6.4 特異性、靈敏性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            3.1 病毒培養(yǎng)
            3.2 病毒PCR檢測(cè)
            3.3 病毒TCID50
            3.4 病毒中和實(shí)驗(yàn)
            3.5 病毒理化實(shí)驗(yàn)
                3.5.1 病毒核酸類型
                3.5.2 氯仿實(shí)驗(yàn)
            3.6 TGEV熒光定量檢測(cè)方法
                3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建
                3.6.2 TGEV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
                3.6.3 特異性、靈敏性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
        4 討論
            4.1 關(guān)于TGEV病毒分離鑒定
            4.2 關(guān)于TGEV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立
    第二章 豬親環(huán)素A的克隆與原核表達(dá)
        1 材料與試劑
            1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.2 菌株與細(xì)胞
            1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 豬CypA基因PCR擴(kuò)增
                2.1.1 引物設(shè)計(jì)
                2.1.2 豬外周血淋巴細(xì)胞的分離
                2.1.3 不同細(xì)胞總RNA的提取
                2.1.4 RT-PCR擴(kuò)增
            2.2 豬CypA基因的克隆測(cè)序與序列分析
            2.3 豬CypA原核表達(dá)載體pET30-CypA的構(gòu)建
                2.3.1 酶切消化與DNA回收
                2.3.2 連接轉(zhuǎn)化與陽性克隆篩選
                2.3.3 豬CypA基因原核表達(dá)菌株的構(gòu)建
            2.4 pET30-CypA原核表達(dá)菌的培養(yǎng)與表達(dá)
            2.5 原核表達(dá)條件的優(yōu)化
            2.6 重組表達(dá)蛋白的可溶性檢測(cè)
            2.7 豬CypA蛋白的大量表達(dá)與純化
            2.8 豬CypA融合表達(dá)蛋白Westernblot鑒定
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            3.1 豬CypA基因PCR擴(kuò)增
            3.2 豬CypA基因遺傳進(jìn)化分析
            3.3 豬CypA原核表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果
            3.4 pET30-CypA原核表達(dá)菌的培養(yǎng)與表達(dá)
            3.5 pET30-CypA原核表達(dá)條件優(yōu)化
            3.6 重組表達(dá)蛋白的可溶性檢測(cè)
            3.7 豬CypA蛋白的大量表達(dá)與純化
            3.8 豬CypA蛋白Westernblot鑒定
        4 討論
            4.1 關(guān)于豬CypA蛋白克隆測(cè)序與原核表達(dá)
            4.3 關(guān)于CypA蛋白的鑒定與純化
    第三章 親環(huán)素A對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒體外復(fù)制的影響
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.2 毒株與細(xì)胞
            1.3 實(shí)驗(yàn)器材
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 豬CypA蛋白表達(dá)純化與透析
            2.2 豬CypA蛋白濃度與純度檢測(cè)
            2.3 豬CypA蛋白對(duì)TGEV復(fù)制的影響
                2.3.1 分組處理
                2.3.2 熒光定量RT-PCR檢測(cè)不同樣品中TGEV含量
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            3.1 豬CypA蛋白純化與透析
            3.2 豬CypA蛋白濃度與純度檢測(cè)
            3.3 豬CypA蛋白對(duì)TGEV一步生長(zhǎng)曲線的影響
        4 討論
            4.1 關(guān)于TGEV一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
            4.2 關(guān)于豬CypA對(duì)TGEV體外復(fù)制影響的初步探索
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附表
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：2980689