發(fā)布時間：2021-01-16 06:12

　　體細胞中導(dǎo)入特定的多能性轉(zhuǎn)錄因子可以將體細胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細胞（Induced pluripotent stem cells, iPS）。截止到目前,已成功的獲得人、牛、山羊、綿羊、小鼠、大鼠、猴、兔、豬等物種的iPS細胞。iPS細胞具有和胚胎干細胞（Embryonic stem cells, ESC）類似的多能性等特性,該技術(shù)對于難以建立胚胎干細胞系的動物無疑提供了一種可行的替代方案。但是,最初建立iPS細胞的傳統(tǒng)方法是利用病毒載體將特定誘導(dǎo)因子Oct4、Sox2、Klf4和c-myc轉(zhuǎn)入體細胞內(nèi),病毒的轉(zhuǎn)染效率不能達到100%,獲得4個誘導(dǎo)因子同時表達的細胞比例很低,且病毒載體會隨機插入到體細胞的基因組中,可能導(dǎo)致正�；虻谋磉_受到影響,或引起基因突變并激活原癌基因的表達。質(zhì)粒載體、多蛋白表達系統(tǒng)、化學小分子以及轉(zhuǎn)座系統(tǒng)雖然盡可能地減少了外源基因和病毒元件的整合,使獲得iPS細胞的安全性獲得提高,但由于操作復(fù)雜、分析困難、制備效率低等原因制約著iPS細胞制備技術(shù)的發(fā)展。相比于以上制備iPS細胞技術(shù),mRNA誘導(dǎo)技術(shù)在理論上存在優(yōu)勢：一方面避開了外源基因插入體細胞基因組的風險；... 

【文章來源】：揚州大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
符號表
前言
第一章 iPS細胞的研究進展
    1 前言
    2 iPS細胞誘導(dǎo)技術(shù)概述
        2.1 采用基因插入不可刪除型運載系統(tǒng)誘導(dǎo)
        2.2 采用基因插入可刪除型運載系統(tǒng)誘導(dǎo)
        2.3 采用無基因插入型運載系統(tǒng)誘導(dǎo)
        2.4 采用無核酸參與型運載系統(tǒng)誘導(dǎo)
    3 iPS細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)體系概述
        3.1 目的細胞的選擇
        3.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)條件
            3.2.1 外源多能性轉(zhuǎn)錄因子的導(dǎo)入
            3.2.2 誘導(dǎo)過程中目的細胞的培養(yǎng)
            3.2.3 iPS細胞的傳代培養(yǎng)
        3.3 iPS細胞的表觀遺傳學檢測
            3.3.1 分子水平
            3.3.2 細胞水平
            3.3.3 動物水平
    4 iPS細胞的應(yīng)用前景
        4.1 構(gòu)建動物模型
        4.2 建立疾病模型
        4.3 新藥發(fā)現(xiàn)及篩選
        4.4 轉(zhuǎn)基因動物研究
第二章 山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因克隆
    1 材料和方法
        1.1 材料與試劑
            1.1.1 菌種和質(zhì)粒來源
            1.1.2 引物、工具酶及試劑
            1.1.3 其他常用試劑配制
        1.2 方法
            1.2.1 山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因克隆及鑒定
                1.2.1.1 山羊睪丸組織、皮膚組織和小腸組織總RNA提取
                1.2.1.2 山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因cDNA的擴增
                1.2.1.3 感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化
                1.2.1.4 菌液PCR擴增目的基因
                1.2.1.5 質(zhì)粒DNA的提取
                1.2.1.6 去除內(nèi)毒素
                1.2.1.7 酶切鑒定
            1.2.2 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列測定及同源性分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的克隆
        2.2 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列測定及同源性分析
    3 討論
第三章 真核表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄因子體外轉(zhuǎn)錄
    1 材料和方法
        1.1 材料與試劑
            1.1.1 材料
            1.1.2 引物、工具酶及試劑
            1.1.3 其他常用試劑配制
        1.2 方法
            1.2.1 真核表達載體構(gòu)建
            1.2.2 轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的體外轉(zhuǎn)錄
                1.2.2.1 質(zhì)粒純化
                1.2.2.2 mRNA“加帽”
                1.2.2.3 mRNA“加尾”
                1.2.2.4 mRNA純化
    2 結(jié)果與分析
        2.1 真核表達載體構(gòu)建
        2.2 轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的體外轉(zhuǎn)錄
    3. 討論
第四章 山羊iPS細胞誘導(dǎo)及培養(yǎng)體系的優(yōu)化
    1 材料和方法
        1.1 材料與試劑
            1.1.1 材料
            1.1.2 試劑
        1.2 方法
            1.2.1 GEF細胞及MEF細胞的分離培養(yǎng)
            1.2.2 飼養(yǎng)層的制備
            1.2.3 培養(yǎng)液的配制
            1.2.4 山羊iPS細胞的獲取與培養(yǎng)
            1.2.5 山羊iPS細胞的傳代、凍存與復(fù)蘇
            1.2.6 山羊iPS細胞的鑒定
                1.2.6.1 形態(tài)觀察
                1.2.6.2 AP染色
                1.2.6.3 免疫熒光檢測
    2 結(jié)果與分析
        2.1 GEF細胞和MEF細胞形態(tài)
        2.2 mRNA誘導(dǎo)山羊體細胞重編程成iPS細胞
        2.3 不同培養(yǎng)體系對山羊體細胞重編程的影響
        2.4 不同培養(yǎng)體系對山羊iPS細胞生長的影響
        2.5 最佳培養(yǎng)體系山羊iPS細胞干性檢測
            2.5.1 AP染色鑒定
            2.5.2 免疫熒光檢測
    3. 討論
第五章 山羊iPS細胞生物學特性及重編程機制研究
    1 材料和方法
        1.1 材料與試劑
            1.1.1 材料
            1.1.2 試劑及引物
        1.2 方法
            1.2.1 GEF細胞及MEF細胞的分離培養(yǎng)
            1.2.2 飼養(yǎng)層的制備
            1.2.3 培養(yǎng)液的配制
            1.2.4 山羊iPS細胞的獲取與培養(yǎng)
            1.2.5 山羊iPS細胞的傳代、凍存與復(fù)蘇
            1.2.6 山羊iPS細胞生物學特性鑒定
                1.2.6.1 形態(tài)觀察
                1.2.6.2 AP染色
                1.2.6.3 免疫熒光檢測
                1.2.6.4 類胚體的制作
                1.2.6.5 RT-PCR和qRT-PCR檢測
                1.2.6.6 Western blot分析
                1.2.6.7 山羊iPS細胞的自發(fā)分化
                1.2.6.8 核型分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 利用mRNA體系誘導(dǎo)獲得山羊iPS細胞
        2.2 山羊iPS細胞具有典型的ES細胞形態(tài)和特異性標記物的表達
        2.3 誘導(dǎo)過程中的重編程機制
        2.4 山羊iPS細胞的表觀遺傳狀態(tài)
        2.5 山羊iPS細胞具有在體外形成三種胚層細胞的能力
    3. 討論
全文結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
碩士期間發(fā)表的論文


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：2980302