J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一類禽腫瘤性疾病。自1988年從雞中首次分離ALV-J以來，ALV-J在世界各地雞群廣泛流行。歐美國家通過凈化措施幾乎在雞群中根除ALV-J,但ALV-J自1999年傳入我國雞群后，就一直在雞群中流行，特別是2008年以來，ALV-J在我國一些蛋雞群中暴發(fā)，發(fā)病率高達(dá)60%，致雞死亡率超過30%，其主要引起臨床癥狀為血管瘤及各實(shí)質(zhì)臟器腫瘤，由于禽白血病是垂直傳播為主的種原性疾病，一些種禽場紛紛被告倒閉。ALV-J給我國養(yǎng)禽業(yè)造成的嚴(yán)重?fù)p失，受到了政府和養(yǎng)殖業(yè)的廣泛關(guān)注。本研究以流行病學(xué)和ALV-J基因組遺傳演化分析為突破口，運(yùn)用反向遺傳技術(shù)闡明了ALV-J致病力增強(qiáng)的分子基礎(chǔ)，并從ALV-J與宿主互作角度解析了ALV-J致病性增強(qiáng)的分子機(jī)制。本研究首先在我國ALV-J暴發(fā)的疫區(qū)進(jìn)行系統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查，共分離鑒定了16株ALV-J蛋雞分離株，遺傳演化分析發(fā)現(xiàn)，ALV-J蛋雞分離株較早期ALV-J肉雞分離株有多個基因發(fā)生了突變或缺失，其中77.8%（21/27）的ALV-J蛋雞分離株env基因存在顯著差異；雖然U3區(qū)中轉(zhuǎn)錄元件都較為保守... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：124 頁

【學(xué)位級別】：博士

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摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 禽白血病
    1.2 我國 J 亞群禽白血病的流行情況
    1.3 J 亞群禽白血病病毒
        1.3.1 病毒的分類地位
        1.3.2 病毒的形態(tài)與理化特性
        1.3.3 病毒的基因組結(jié)構(gòu)及蛋白組成
        1.3.4 病毒復(fù)制周期
        1.3.5 病毒致病致瘤機(jī)制
    1.4 血管內(nèi)皮生長及其受體與腫瘤發(fā)生
        1.4.1 血管內(nèi)皮生長因子 A 與血管生成
        1.4.2 血管內(nèi)皮生長因子受體 2 與血管生成
        1.4.3 血管生成與腫瘤發(fā)生
    1.5 p53 與病毒及腫瘤
        1.5.1 認(rèn)知 p53
        1.5.2 p53 基因突變與腫瘤
        1.5.3 病毒與 p53
        1.5.4 p53 與病毒引起的禽類腫瘤
    1.6 microRNAs 與反轉(zhuǎn)錄病毒
        1.6.1 microRNAs 的發(fā)現(xiàn)與命名
        1.6.2 microRNAs 的生成與調(diào)控機(jī)制
        1.6.3 microRNAs 與反轉(zhuǎn)錄病毒
    1.7 本研究的目的與意義
第二章 我國 ALV-J 遺傳演化分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 載體、菌株和細(xì)胞
        2.1.2 臨床樣品
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 病毒分離與前病毒 DNA 提取
        2.2.2 病毒基因克隆與測序
        2.2.3 DNA 序列比對及進(jìn)化樹分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 ALV-J 的病毒分離及鑒定
        2.3.2 ALV-J env 基因的遺傳演化分析
        2.3.3 ALV-J U3 的進(jìn)化分析
        2.3.4 ALV-J 3’UTR 的進(jìn)化分析
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 3’UTR 205nt 缺失增強(qiáng) ALV-J 致病性
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 載體、菌株和細(xì)胞
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 ALV-J 感染性克隆構(gòu)建策略
        3.2.2 病毒拯救和鑒定
        3.2.3 拯救病毒的體外復(fù)制動力學(xué)
        3.2.4 p27 蛋白表達(dá)和反轉(zhuǎn)錄酶活性鑒定
        3.2.5 亞病毒基因組構(gòu)建
        3.2.6 亞病毒基因組中 p27 蛋白的表達(dá)和未剪切 RNA 的核質(zhì)穿梭
        3.2.7 拯救病毒的體內(nèi)致病性
        3.2.8 數(shù)據(jù)分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 拯救缺失 205nt 和嵌合 205nt 的兩株 ALV-J 病毒
        3.3.2 205nt 缺失增強(qiáng) ALV-J 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的復(fù)制
        3.3.3 205nt 缺失促進(jìn) ALV-J 未剪切 RNA 從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)
        3.3.4 205nt 缺失增強(qiáng) ALV-J 在體內(nèi)的復(fù)制
        3.3.5 205nt 缺失增強(qiáng) ALV-J 致瘤性和致死率
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 ALV-J 致病性增強(qiáng)的分子機(jī)制
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 載體、菌株和細(xì)胞
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 VEGF-A 和 VEGFR-2 表達(dá)
        4.2.2 ALV-J 病毒載量及其插入位點(diǎn)的鑒定
        4.2.3 p21WAF1的表達(dá)和 p53 表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.4 DF-1 原型 p53 蛋白和突變型 p53 蛋白的細(xì)胞定位
        4.2.5 U3 介導(dǎo)的報(bào)告基因載體和亞病毒基因組構(gòu)建
        4.2.6 亞病毒基因組中 p27 蛋白的表達(dá)和未剪切 RNA 的核質(zhì)穿梭
        4.2.7 染色體免疫共沉淀（CHIP）驗(yàn)證 p53 蛋白與 ALV-J U3 互作
        4.2.8 凝膠阻滯試驗(yàn)（EMSA）驗(yàn)證 p53 蛋白與 U3 互作作用域
        4.2.9 數(shù)據(jù)分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 ALV-J 致瘤組織中 VEGF-A 及其受體 VEGFR-2 高水平表達(dá)
        4.3.2 VEGF-A 和 VEGFR-2 表達(dá)水平與 ALV-J 復(fù)制呈正相關(guān)
        4.3.3 ALV-J 持續(xù)感染致 TP53 基因突變
        4.3.4 DF-1 細(xì)胞中原型 p53 蛋白抑制 ALV-J U3 活性
        4.3.5 突變型 p53 蛋白失去對抑制 ALV-J 復(fù)制的作用
        4.3.6 ALV-J 感染 DF-1 細(xì)胞增加 DF-1 原型 p53 蛋白表達(dá)
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 宿主 miRNAs 在 ALV-J 致病過程中的作用
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 載體、菌株，毒株和細(xì)胞
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要儀器
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 預(yù)測 ALV-J 基因組編碼 miRNAs 的預(yù)測
        5.2.2 預(yù)測 ALV-J 編碼 miRNAs 前體分子的驗(yàn)證
        5.2.3 原型及突變型報(bào)告基因的構(gòu)建和檢測
        5.2.4 預(yù)測 miRNA 與靶標(biāo)的結(jié)合
        5.2.5 宿主 miRNAs 抑制子和表達(dá)載體的構(gòu)建
        5.2.6 宿主 miRNAs 的 Northern Blot 驗(yàn)證
        5.2.7 原型 ALV-J 和突變型 ALV-J 的拯救
        5.2.8 ALV-J p27 蛋白的表達(dá)及病毒復(fù)制
        5.2.9 宿主 gga-miR-1650 莖環(huán)法熒光定量 PCR 檢測
        5.2.10 數(shù)據(jù)分析
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 ALV-J 基因組中 miRNAs 前體分子預(yù)測
        5.3.2 Northern Blot 檢測不到預(yù)測的 ALV-J 編碼的前體分子
        5.3.3 DF-1 細(xì)胞中可能存在 miRNAs 調(diào)控 ALV-J 5’UTR 介導(dǎo)的報(bào)告基因活性
        5.3.4 gga-miR-1650 調(diào)控 5’UTR 介導(dǎo)的報(bào)告基因活性
        5.3.5 ALV-J 5’UTR 是 gga-miR-1650 的靶標(biāo)
        5.3.6 過表達(dá) gga-miR-1650 抑制 ALV-J 蛋白表達(dá)和病毒復(fù)制
        5.3.7 ALV-J 感染引起細(xì)胞 gga-miR-1650 表達(dá)上調(diào)
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第六章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2009年我國部分地區(qū)禽白血病分子流行病學(xué)調(diào)查[J]. 高玉龍,邵華斌,羅青平,潘偉,秦立廷,孫芬芬,劉超男,高宏雷,祁小樂,王笑梅.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2010(01)
[2]中國麻雞中發(fā)現(xiàn)禽J亞群白血病[J]. 成子強(qiáng),張利,劉思當(dāng),張玲娟,崔治中.  微生物學(xué)報(bào). 2005(04)
[3]突變型抑癌基因p53在蛋雞J亞群禽白血病中的表達(dá)[J]. 徐鑌蕊,董衛(wèi)星,何召慶,余春明,李寧,馮小宇,L.F.Lee,Maoxiang Li.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2003(03)

博士論文
[1]蛋雞ALV-J的分離鑒定及分子致瘤機(jī)制的研究[D]. 曲悅.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012



本文編號：2975236