睪丸是精子生成和分泌雄性激素的場所，是雄性哺乳動物最重要的生殖器官。小鼠的zfx基因位于X染色體短壁上的性別決定區(qū)（TDF）內(nèi)，是鋅脂蛋白家族中的一員。zfx可以作為一個(gè)較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而引導(dǎo)靶基因通過核膜定位在X精子的細(xì)胞核內(nèi)，可能對某些基因在X精子發(fā)生過程中具有轉(zhuǎn)錄激活作用，與X精子的形成發(fā)生有關(guān)。本研究根據(jù)zfx基因的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了4個(gè)shRNA片段，進(jìn)行小鼠體外和體內(nèi)zfx基因的RNAi實(shí)驗(yàn)，采用qRT-PCR分析干擾后zfx基因的mRNA表達(dá)水平，并統(tǒng)計(jì)了經(jīng)干擾后子代小鼠的性別比例。具體研究結(jié)果如下：1.根據(jù)GenBank（NCBI）提供的完整的小鼠zfx基因mRNA序列，按照RNAi設(shè)計(jì)原則，針對該基因的編碼區(qū)設(shè)計(jì)并合成4對shRNA干擾片段。以Clontech公司（USA）RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-ZsGreen作為載體，構(gòu)建了小鼠靶向zfx基因的shRNA表達(dá)載體pqz1-paz4。經(jīng)過酶切鑒定和測序證實(shí)，實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的4個(gè)表達(dá)載體中含有設(shè)計(jì)合成的干擾序列，且上下游表達(dá)調(diào)控元件完整，插入序列的位置正確。說明這4個(gè)shRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功，可以... 

【文章來源】：石河子大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
論文中常用縮寫詞英漢對照表
前言
綜述部分
    一、動物性別控制的研究
    二 RNA干擾的原理、機(jī)制及其在動物繁殖中的應(yīng)用
        1. RNAi的發(fā)展史
        2. RNAi的作用機(jī)理
            2.1 參與RNAi機(jī)制的的主要分子
                2.1.1 dsRNA分子
                2.1.2 Dicer酶
                2.1.3 siRNA分子
                2.1.4 RISC
                2.1.5 RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）
            2.2 RNAi作用機(jī)制
        3. siRNAs的常見制備
            3.1 化學(xué)合成
            3.2 siRNA 表達(dá)載體
            3.3 用RNaseIII消化大片斷dsRNA制備siRNA
            3.4 體外轉(zhuǎn)錄
            3.5 siRNA表達(dá)框架
        4. siRNA的介導(dǎo)途徑
        5. 檢測RNAi結(jié)果的方法
        6. RNAi技術(shù)在動物繁殖中的應(yīng)用
            6.1 RNAi應(yīng)用于動物卵母細(xì)胞
            6.2 RNAi應(yīng)用與精子發(fā)生
            6.3 RNAi與動物的胚胎發(fā)育
        7. 展望
試驗(yàn)研究
    實(shí)驗(yàn)一 小鼠zfx基因shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建
        1. 材料與方法
            1.1 主要儀器
            1.2 主要試劑
            1.3 方法
        2. 結(jié)果與分析
            2.1 目標(biāo)序列的初步篩選
            2.2 表達(dá)載體的克隆與酶切鑒定
            2.3 重組質(zhì)粒表達(dá)載體的測序鑒定
        3. 討論
            3.1 RNAi的作用原理
            3.2 siRNA的設(shè)計(jì)原則
            3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的檢測
    實(shí)驗(yàn)二 zfx基因shRNA表達(dá)載體的細(xì)胞RNA干擾試驗(yàn)
        1. 材料與方法
            1.1 主要試劑
            1.2 主要儀器
            1.3 主要PCR引物
            1.4 主要實(shí)驗(yàn)動物
        2. 主要實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的大量制備與純化
            2.2 生精細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
            2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生精細(xì)胞
            2.4 測定生精細(xì)胞zfx基因mRNA表達(dá)水平
        3. 結(jié)果與分析
            3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生精細(xì)胞
            3.2 PCR結(jié)果分析
            3.3 zfxmRNA表達(dá)水平
        4. 討論
    實(shí)驗(yàn)三 zfx基因shRNA表達(dá)載體的體內(nèi)RNA干擾試驗(yàn)
        1. 材料與方法
            1.1 主要試劑
            1.2 主要儀器
            1.3 主要實(shí)驗(yàn)動物
            1.4 zfx基因shRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建
            1.5 主要PCR引物
            1.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的大量制備與純化
            1.7 小鼠體內(nèi)zfx基因RNAi實(shí)驗(yàn)
            1.8 測定睪丸中zfx基因mRNA表達(dá)水平
        2. 結(jié)果與分析
            2.1 PCR結(jié)果分析
            2.2 小鼠睪丸中zfxmRNA表達(dá)水平
            2.3 F1代小鼠的性別比例
        3. 討論
參考文獻(xiàn)
結(jié)論
創(chuàng)新點(diǎn)
致謝
作者簡介
導(dǎo)師評閱表



本文編號：2973820