坦布蘇病毒（Tembusu Virus,TMUV）感染是由TMUV引起的一種新發(fā)傳染性疾病。該病自2010年起持續(xù)危害我國水禽養(yǎng)殖業(yè),造成嚴重經(jīng)濟損失。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,1ncRNA）是一類長度大于200個核苷酸,缺乏編碼能力的RNA,最近大量研究報道其具有多種生物學功能,在病毒感染過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。為探究lncRNA在TMUV感染中的可能作用,本研究以鴨胚成纖維細胞（duck embryo fibroblast cells,DEFs）為試驗材料,利用高通量RNA測序（RNA-Seq）技術(shù)揭示TMUV感染誘導(dǎo)的lncRNA表達譜變化,通過生物信息學手段預(yù)測差異表達1ncRNA的生物學功能,并對篩選的差異表達1ncRNA進行表達驗證和初步的功能研究。主要內(nèi)容如下:1、為探討TMUV感染DEFs后病毒的復(fù)制情況與宿主細胞的生物學特性變化,本研究利用DEFs為研究對象,分別接種3 MOI的TMUV,并在l2 hpi,24 hpi和48 hpi檢測病毒復(fù)制、細胞周期和細胞凋亡三個生物學指標。結(jié)果表明,隨著病毒感染時間的延長,細胞中的病毒滴度逐漸... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

黃病毒的結(jié)構(gòu)示意圖(Heinzetal.,2012)

山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文9可以作為誘餌捕獲轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性(Bondetal.,2009)。例如，Evf-2可以作為關(guān)鍵激活因子激活參與轉(zhuǎn)錄過程的蛋白，調(diào)節(jié)同源盒轉(zhuǎn)錄因子2（DLX2）和熱休克蛋白（HSP）的轉(zhuǎn)錄(Fengetal.,2006)。除了作為正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，有一些1ncRNA也可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用。例如，周期蛋白D1（CCND1）能夠在病理狀態(tài)下產(chǎn)生多種lncRNA，它們能夠與RNA結(jié)合蛋白脂肪肉瘤轉(zhuǎn)運蛋白（TLS），導(dǎo)致其蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，進而使CCND1轉(zhuǎn)錄障礙，阻止了細胞進程(Wangetal.,2008)。除了表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，1ncRNA能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達，包括可變剪切、編輯、翻譯以及轉(zhuǎn)運等mRNA事件(Moore.,2005)。在某些情況下，1ncRNA與己知蛋白編碼基因形成RNA互補雙鏈，成為mRNA的重疊基因中關(guān)鍵順式調(diào)控元件，導(dǎo)致正義鏈的可變剪切(Beltranetal.,2008)。1ncRNA可以通過調(diào)節(jié)翻譯過程在轉(zhuǎn)錄后水平增加蛋白質(zhì)的合成(Carrierietal.,2012;Liuetal.,2002)。有的1ncRNA通過改變蛋白質(zhì)的亞細胞定位來調(diào)控蛋白活性(Willinghametal.,2005)。lncRNA也可以作為miRNA的海綿競爭結(jié)合miRNA，從而上調(diào)miRNA靶基因的表達(Hansenetal.,2013)。圖3lncRNA的功能模式(www.serengeseba.com)Fig.3ThefunctionpatternoflncRNA1.3.4lncRNA的作用機制1ncRNA可以作為信號分子、誘餌分子、支架分子和引導(dǎo)分子發(fā)揮基因調(diào)控作用。作為信號分子，1ncRNA的轉(zhuǎn)錄具有組織和時空特異性，可以在不同的細胞中對不同刺激做出特異性反應(yīng)。作為誘餌分子，1ncRNA能夠與染色質(zhì)修飾因子、轉(zhuǎn)錄因子以及剪切因子形成蛋白復(fù)合體，起到負調(diào)節(jié)效應(yīng)器的作用，防止調(diào)節(jié)蛋白對基因表達的調(diào)控(Martianovetal.,2007)。作為支架分子，1ncRNA可以將相關(guān)效應(yīng)分子組分組合成復(fù)合

坦布蘇病毒感染的鴨胚成纖維細胞中長鏈非編碼RNA的表達譜變化及其功能初步研究20圖4RNA-Seq的流程Fig.4ProcessofRNA-Seq2.2.2.2原始數(shù)據(jù)的整理、過濾及質(zhì)量評估樣品通過上述RNA-Seq流程可以獲得下機數(shù)據(jù)，即原始數(shù)據(jù)（RawData）。通過統(tǒng)計各樣品的RawData，例如樣品名稱、模糊堿基所占百分比（N(%)）、堿基識別準確率在99%以上的堿基所占百分比（Q20(%)）、堿基識別準確率在99.9%以上的堿基總數(shù)（Q30）以及堿基識別準確率在99.9%以上的堿基所占百分比（Q30(%)）等，可以對測序質(zhì)量進行初步評估。RawData中混有一部分帶接頭或者低質(zhì)量的序列，它們的存在對后續(xù)的生物信息學分析產(chǎn)生一定的誤差，因此有必要去除這些低質(zhì)量的數(shù)據(jù)。利用Cutadapt軟件對原始數(shù)據(jù)進行接頭序列、低質(zhì)量序列和重復(fù)冗余序列的去雜。通過Bowtie2和Tophat2軟件建立參考基因組索引并將高質(zhì)量序列比對到參考基因組。Tophat2比對時，默認序列和參考基因組序列的Mismatch在2個之內(nèi)，即為Mapping成功。如果Mapping比例大于70%，不僅說明參考基因組選擇合格，而且能確定實驗過程中沒有污染。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Analysis of Expression Profiles of Long Noncoding RNAs and mRNAs in A549 Cells Infected with H3N2 Swine Influenza Virus by RNA Sequencing[J]. Yina Zhang,Tianqi Yu,Yingnan Ding,Yahui Li,Jing Lei,Boli Hu,Jiyong Zhou.  Virologica Sinica. 2020(02)
[2]Regulation of cell survival and death during Flavivirus infections[J]. Sounak Ghosh Roy,Beata Sadigh,Emmanuel Datan,Richard A Lockshin,Zahra Zakeri.  World Journal of Biological Chemistry. 2014(02)



本文編號：2973794