選取弓形蟲基因組中高度保守的多拷貝基因529bp重復(fù)序列、ITS-1序列和B1基因作real-time PC R檢測靶基因,建立檢測弓形蟲的三重SYBRGreen I實時熒光定量PCR的檢測方法并且與ELISA檢測方法進(jìn)行比較。將529bp重復(fù)序列、B1基因、ITS-1序列的選定擴(kuò)增序列進(jìn)行克隆、測序構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品；將構(gòu)建3個標(biāo)準(zhǔn)品放在一個體系中進(jìn)行擴(kuò)增,進(jìn)行三重SYBRGreenI實時熒光定量PCR。529bp、ITS-1和B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）均為0.998,并且擴(kuò)增效率均為96.724%,擴(kuò)增片段的Tm值分別為86.5±0.5℃、78.8±0.5℃、83.1±0.5℃。構(gòu)建的三重SYBRGreen Ⅰ實時熒光定量PCR特異性試驗表明,529bp、ITS-1和B1有特異性的溶解曲線峰值分別是86.2℃、78.9℃和83.3℃,陰性對照無擴(kuò)增曲線。敏感性試驗表明,529bp、ITS-1和B1序列最低檢出限分別為173copies/μL、 123copies/μL、和135copies/μL; Tm值的批內(nèi)、批間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于0.3%. ELISA檢測豬弓形蟲IgG抗體... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１３標(biāo)準(zhǔn)品的洛解曲線??Ｆｉｇ．?１３?Ｍｅｌｔ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｐｒｏｄｕ幻Ｓ??２．４．３?ＳＹＢＲ?Ｇｒｅｅｎ?Ｉ巧光定量ＰＧＲ重復(fù)性??

??（３）從圖１３中可Ｗ看出，ＳＹＢ民Ｇｒｅｅｎ?Ｉ?ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＰＣ民的溶解曲線具有較強(qiáng)的??特異性，無非特異性擴(kuò)增，ＰＵＭ－Ｔ－５２９ｂｐ、ＰＵＭ－Ｔ－ＩＴＳ－１和ＰＵＭ－Ｔ－Ｂ１標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)??增片段的Ｔｍ值分別為８６．５±０．５°Ｃ，?７８．８±０．５°Ｃ和８３．１±０．５‘Ｃ并作為；重ＳＹＢ民??Ｇｒｅｅｎ?Ｉ?ｒｅａｌｔｉｍｅ?ＰＣ民溶解曲線Ｔｍ值的陽性對照Ｔｍ值，見圖１３。??Ｍｅ化?Ｃｕｒｖｅ??＂．９?＾＾￣??：：７８＇４獻(xiàn)品??言＇（ＩＴＳ－。?１１?＼??吉。．Ｖ?；?！‘！?８６．５?：；??７〇ｎｊ?７５�。迹�?８０￣￣８５．０?９０．０?９５．５??｝?ｎｉ；Ｋ６．５？?Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（＊Ｃ?）??圖１３標(biāo)準(zhǔn)品的洛解曲線??Ｆｉｇ．?１３?Ｍｅｌｔ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｐｒｏｄｕ幻Ｓ??２．４．３?ＳＹＢＲ?Ｇｒｅｅｎ?Ｉ巧光定量ＰＧＲ重復(fù)性??選取不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品為樣本，每個樣本做Ｈ個重復(fù)，每次之間誤差不到??１個循環(huán)，可見ＳＹＢＲ?Ｇｒｅｅｎ?Ｉ英光定量ＰＣＲ較高重復(fù)性，見表７。??表７?ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ?Ｉ巧光定量ＰＣＲ批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗（ｎ＝３）??Ｔａｂ．?７?Ｉｎｔｒａ?ａｎｄ?ｉｎｔｅｒ－ａｓｓ巧?ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ?化巧?ｏＨｈｅ?ＳＹＢＲＧ化ｅｎ?Ｉ?ｒｅａｌ?ｔｉｍｅ?ＰＣ民（ｎ＝３）??重組質(zhì)粒的濃度?批內(nèi)變異試驗?批內(nèi)變異試驗??基

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：2970422