為實(shí)現(xiàn)水貂阿留申病毒（Aleutian disease virus,ADV）部分VP2基因的可溶性表達(dá),進(jìn)一步探究目的蛋白的反應(yīng)原性,本研究利用基因工程技術(shù)克隆ADV衣殼蛋白VP2部分基因,并亞克隆至原核表達(dá)載體pET30a（+）中,獲得重組表達(dá)載體pET-30a-M,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE確定蛋白表達(dá)形式,嘗試降低誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑濃度來增加可溶性蛋白表達(dá)量,但效果不顯著;隨后,為增加可溶性表達(dá),嘗試將pET-30a-M分別與pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16 5種伴侶蛋白共表達(dá)。通過SDS-PAGE篩選有效的伴侶蛋白,將伴侶蛋白pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16 5種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）,將pET-30a-M質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入含各種伴侶蛋白的感受態(tài)細(xì)胞。各種共表達(dá)菌株經(jīng)雙抗性篩選,誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá)情況。并從誘導(dǎo)溫度和伴侶蛋白誘導(dǎo)劑L-Arabinose劑量?jī)蓚�(gè)方面篩選最佳表達(dá)條件。SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果表明重組表達(dá)載體pET-30a-M誘導(dǎo)表達(dá)后... 

【文章來源】：中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,40(09)北大核心

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【部分圖文】：

VP2部分基因片段的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

在37℃、IPTG 1.0 mmol/L、誘導(dǎo)4 h的條件下,分析蛋白表達(dá)情況,SDS-PAGE結(jié)果顯示,與空載體全菌及誘導(dǎo)前的全菌相比,誘導(dǎo)后的全菌在約70 000處有明顯條帶,與預(yù)期的蛋白大小一致(圖3),蛋白主要以包涵體形式存在;在相同誘導(dǎo)時(shí)間(4 h)和IPTG誘導(dǎo)劑濃度(1.0 mmol/L)的條件下,分別以不同溫度16,25,30和37℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)4 h后,取出菌液,超聲破碎后,將超聲后的上清通過SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示,溫度改變并不能有效增加可溶性蛋白表達(dá)(圖4)。在相同誘導(dǎo)時(shí)間(4 h)和誘導(dǎo)溫度(37℃)條件下,分別以0.1,0.2,0.4,0.6,0.8和1.0 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),利用SDS-PAGE分析誘導(dǎo)表達(dá)后超聲破碎的上清,結(jié)果顯示IPTG濃度的改變并不能有效增加可溶性蛋白的表達(dá)(圖5)。圖4 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)的影響


本文編號(hào)：2970332