豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus PEDV）是引起豬的急性、接觸性腸道傳染病的主要病原體,PEDV可在豬群中持續(xù)存在,主要癥狀為嘔吐、腹瀉和脫水,各種年齡和品種的豬都易感。感染發(fā)病后引起的仔豬病死率偏高,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前我國主要采用疫苗免疫的方法防控豬流行性腹瀉（PED）,但是疫苗免疫存在免疫空白期,仔豬的免疫功能不完善,易發(fā)生PED,用基因工程制備的單域抗體可以彌補(bǔ)這個缺陷。PEDV纖突蛋白（Spike protein S蛋白）位于病毒表面,包含病毒的多個中和表位和受體結(jié)合域,與病毒的抗原性和吸附入侵密切相關(guān)。S蛋白是目前新型基因工程疫苗和被動免疫制劑研發(fā)的主要靶點(diǎn)。單域抗體具有高水溶性、低免疫原性、高抗原結(jié)合活性和高穩(wěn)定性等特點(diǎn),作為被動免疫,效應(yīng)快,不需經(jīng)過潛伏期,一經(jīng)輸入,可立即獲得免疫力,能夠有效防控疾病。本試驗(yàn)中使用S蛋白作為篩選抗原從已構(gòu)建好的噬菌體抗體庫進(jìn)行篩選,選取了Phage ELISA鑒定結(jié)果中對PEDV相對結(jié)合能力較強(qiáng)的一株陽性克隆,通過質(zhì)粒重組,將單域抗體基因片段與表達(dá)載體pET-28a連接,并... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：44 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

7抗體氨基酸序列及抗體功能區(qū)分析結(jié)果

圖 1 重組噬菌體對 PEDV S 蛋白的免疫活性的 ELISA 檢測Fig.1 ELISAassay of the immunoreactivity of recombinant phage on S protein of PEDVDV S 蛋白特異性單域抗體 VHH 序列分析的 20 個陽性克隆經(jīng)過基因序列測定和分析后，將序列相同的克隆分為 種不同的序列，其中 9、33、35、50、65、67 號克隆是相同的序列，78、81 是相同的序列， 41、75 是相同的序列，剩余的 6 個克隆有 6通過與網(wǎng)上已公開和發(fā)表的駱駝 VHH 抗體基因序列比對后，發(fā)現(xiàn)有單域抗體 VHH 基因片段，我們選取結(jié)合活性較高的 7 號克隆進(jìn)行了能鑒定，S7 抗體氨基酸序列分析結(jié)果如圖 2。

圖 3 S7 克隆質(zhì)粒酶切和 pET-28a 質(zhì)粒酶切結(jié)果Fig3 S7 plasmidand pET-28a plasmid was digested by Nco I and NotlaneM：DL5000 Marker，Lane1S7 克隆質(zhì)粒，Lane2 pET-28a 質(zhì)粒28a 重組菌落 PCR 鑒定結(jié)果T-28a 重組菌落為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增鑒定，經(jīng) 1 400 bp 左右的條帶，與預(yù)期的片段大小相符。結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬流行性腹瀉病毒流行毒株的分離與鑒定[J]. 周書亭,謝洋洋,丁思嘉,鄭煜名,蔡雨豪,羅依然,袁聰俐,楊志彪.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2017(08)
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碩士論文
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[3]豬流行性腹瀉病毒S蛋白的單抗制備及夾心ELISA檢測PEDV方法建立與應(yīng)用[D]. 王明月.吉林大學(xué) 2016
[4]MSTN納米抗體的篩選和功能驗(yàn)證[D]. 李尤簡.石河子大學(xué) 2015
[5]新生仔豬流行性腹瀉病理學(xué)觀察及發(fā)病相關(guān)因素調(diào)查[D]. 任慶海.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[6]犬細(xì)小病毒單域抗體庫篩選及單域抗體表達(dá)研究[D]. 詹俊杰.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013



本文編號：2969426