豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS）是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）感染引起的豬的一種慢性呼吸道傳染病。滅活疫苗接種是目前控制該病最主要的策略,但這種疫苗免疫保護效果有限,也不能阻斷病原在呼吸道的定殖及病原在豬群內和豬群之間的傳播。因此,迫切需要開發(fā)新一代更加有效的疫苗。疫苗制備的核心之一是篩選具有良好免疫保護效果的抗原。本實驗室已經(jīng)建立了豬肺炎支原體血清體液免疫顯性蛋白抗原的篩選方法和區(qū)分高免血清與恢復期血清體液免疫顯性蛋白抗原的方法,能大規(guī)模篩選血清體液免疫顯性蛋白抗原。因此,本研究在優(yōu)化前期已經(jīng)建立的區(qū)分高免血清與恢復期血清的血清體液免疫顯性蛋白抗原方法的基礎上,篩選血清體液免疫顯性蛋白和區(qū)分高免血清與恢復期血清的血清體液免疫顯性蛋白抗原,為豬肺炎支原體保護性抗原的篩選提供候選蛋白抗原。1.區(qū)分豬肺炎支原體高免血清與恢復期血清的血清體液免疫顯性蛋白抗原ELISA方法的優(yōu)化目的:優(yōu)化本實驗室前期建立的區(qū)分豬肺炎支原體高免血清與恢復期血清的血清體液免疫顯性蛋白抗原ELISA方法。方法:將GST... 

【文章來源】：西南大學重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

SDS-PAGE檢測GST-Mhp366重組蛋白、GST蛋白的表達

第三章區(qū)分豬肺炎支原體高免血清和恢復期血清的血清體液免疫顯性蛋白抗原ELISA方法的優(yōu)化29圖3-2最佳血清稀釋度和最佳酶標二抗工作濃度的確定Fig.3-2DeterminationofoptimaldilutionofserumandHRP-conjugatedrabbitanti-pigIgG3.4討論本實驗室已建立了一種快速鑒定豬肺炎支原體血清體液免疫顯性蛋白抗原ELISA方法[72]，能夠快速篩選出血清體液免疫顯性蛋白抗原。鑒定出的血清體液免疫顯性蛋白可進一步用于尋找區(qū)分性血清體液免疫顯性蛋白。但在建立該方法時，直接采用了快速鑒定豬肺炎支原體免疫顯性蛋白抗原ELISA方法中的最佳抗原包被濃度和最佳封閉液選擇的條件[73]，在此方法中未對這兩個條件進行再次探索，由此建立的方法不夠精確、嚴謹。在本章節(jié)中，對最佳抗原包被濃度、最佳封閉液的選擇條件進行摸索，對最佳血清稀釋度與最佳酶標二抗工作濃度的條件再次確定，由此確定了區(qū)分性血清體液免疫顯性蛋白抗原ELISA方法中的最佳參數(shù)，優(yōu)化了區(qū)分性血清體液免疫顯性蛋白抗原ELISA方法。Meens等人研究表明豬恢復期血清對Mhp366蛋白具有很強的免疫反應，而不能識別高免血清[71]。此外，用Mhp366蛋白多克隆抗體，不能在體外培養(yǎng)的Mhp菌株中檢測到Mhp366。因此，可以基于Mhp366蛋白區(qū)分高免血清與恢復期血清。豬血清中可能含有與其他細菌蛋白的抗體，為了盡量避免這些抗體的干擾，所有血清樣品均用GST工程菌裂解液進行了預吸附。同時，為了得到更可靠的Mhp366蛋白與血清反應的相對OD450值，我們用GST-Mhp366重組菌裂解物與血清反應得到的OD450減去GST工程菌細菌裂解物與血清反應得到的OD450。通常很難在ELISA標準化中確定臨界值，因為必須將OD的連續(xù)變化轉換為定性反應（陽性或陰性）[74]。先前已將許多標準應用于ELISA的臨

第四章部分豬肺炎支原體蛋白的原核可溶表達41（3）每管加入20μLPBS和3μLPreScissionProtease，室溫旋轉（25r/min）酶切5h或旋轉酶切過夜，4℃10000r/min離心1min，取12μL上清，加入3μL5×SDS-PAGE上樣緩沖液，105℃處理10min，瞬時離心。（4）12%SDS-PAGE電泳，檢測重組蛋白的酶切情況。4.3結果4.3.1基因片段的PCR擴增結果以pGEX-6P-1-mhp246質粒為模板，PCR擴增出大小分別為759bp、702bp的mhp246-N、mhp246-C片段；以pGEX-6P-1-mhp353質粒為模板，PCR擴增出大小為873bp的mhp353-C片段。所有目的片段大小均與預計大小相符。圖4-1PCR擴增mhp246-N、mhp246-C、mhp353-C片段Fig.4-1Amplificationofmhp246-N,mhp246-Candmhp353-CfregmentsbyPCR4.3.233個重組質粒的酶切鑒定提取33個重組菌中的重組質粒，經(jīng)雙酶切后，得到與預期大小相同的目的基因片段4984bp、4974bp、4968bp的載體片段和與預期大小相符的基因片段（圖4-2A），片段大小分別為822bp（mhp024）、720bp（mhp067-1）、828bp（mhp067-2）、1044bp（mhp067-3）、1440bp（mhp067-4）、681bp（mhp067-5）、1044bp（mhp144）、1053bp（mhp170）、759bp（mhp246-N）、702bp（mhp246-C）、828bp（mhp263）、1356bp（mhp274）、1383bp（mhp275）、543bp（mhp303）、894bp（mhp320）、894bp（mhp326）、648bp（mhp347）、873bp（mhp353-C）、669bp（mhp354）、1404bp（mhp435）、930bp（mhp440）、1773bp（mhp444）、1395bp（mhp460）、1542bp（mhp482）、1824bp（mhp520）、552bp（mhp565-1）、1101bp（mhp565-2）、549bp（mhp565-3）、1047bp（mhp565-4）、837bp（mhp565-5）、

【參考文獻】：
期刊論文
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