豬鏈球菌是豬的常見病原體,豬鏈球菌病是多種鏈球菌引起豬的一類疾病的總稱,其中由豬鏈球菌2型引起的疾病是一種重要的人畜共患病。該病原可使豬產(chǎn)生腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、敗血癥等多種病癥甚至可引起急性死亡,同時(shí)還可感染人并致人死亡。根據(jù)菌體表面莢膜多糖的差異,將其分為35個(gè)血清型（1-34型及1/2型）,其中以2型分布最普遍,致病力也最強(qiáng),1型、7型以及9型則次之。本研究首先建立了一種對(duì)豬鏈球菌2型3個(gè)重要毒力因子CPS2J、MRP、EF同時(shí)檢測(cè)的三重?zé)晒舛縋CR方法。針對(duì)臨床采集標(biāo)本容易污染、不易分離出典型菌落的現(xiàn)狀,研究出了一種豬鏈球菌選擇性增菌液,提高了其臨床分離效率,縮短了檢測(cè)時(shí)間。基于以上兩部分研究,對(duì)上海奉賢地區(qū)臨床表觀健康豬群的豬鏈球菌攜帶情況進(jìn)行了檢測(cè)。依據(jù)GenBank上的CP2SJ、MRP、EF基因保守序列,用軟件Primer Express 3.0設(shè)計(jì)各自對(duì)應(yīng)的引物以及Taqman控針,其中CP2SJ、MRP、EF探針5’端分別標(biāo)記FAM、HEX、CY5熒光發(fā)射基團(tuán),3’均以BHQ1熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記。通過對(duì)反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件的優(yōu)化,建立了一種Taqman探針法... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號(hào)及縮略語
第一篇 文獻(xiàn)綜述
    第一章 豬鏈球菌的研究概述
        1 豬鏈球菌簡(jiǎn)介
            1.1 豬鏈球菌的歷史概況
            1.2 豬鏈球菌病原學(xué)
                1.2.1 分類
                1.2.2 形態(tài)及染色特性
                1.2.3 培養(yǎng)特性
                1.2.4 抗抗力
                1.2.5 耐藥性
            1.3 豬鏈球菌流行病學(xué)研究
            1.4 豬鏈球菌毒力因子研究
                1.4.1 莢膜多糖（CPS）
                1.4.2 溶菌酶釋放蛋白（MRP）和胞外蛋白因子（EF）
                1.4.3 溶血素（SLY）
                1.4.4 谷氨酸脫氫酶（GDH）
                1.4.5 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）
                1.4.6 纖連蛋白和纖連蛋白原結(jié)合蛋白（FBPS）
                1.4.7 毒力相關(guān)序列（orf2）
                1.4.8 89k毒力島
                1.4.9 其他毒力因子
            1.5 致病機(jī)制
            1.6 豬鏈球菌的檢測(cè)方法及研究進(jìn)展
                1.6.1 經(jīng)典鑒定方法
                1.6.2 分子生物學(xué)方法
            1.7 本試驗(yàn)研究的目的與意義
第二篇 試驗(yàn)部分
    第二章 豬鏈球菌2型主要毒力因子三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立
        摘要
        1 試驗(yàn)材料
            1.1 主要試劑
            1.2 主要設(shè)備
            1.3 種系背景明確的試驗(yàn)對(duì)照菌株
            1.4 引物及探針
            1.5 相關(guān)主要試劑的制備
            1.6 豬鏈球菌2型細(xì)菌基因組DNA的提取
            1.7 三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備
                1.7.1 目的片段的PCR擴(kuò)增及電泳成像
                1.7.2 PCR產(chǎn)物膠回收
                1.7.3 膠回收產(chǎn)物連接
                1.7.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
                1.7.5 陽性克隆的PCR篩選及測(cè)序驗(yàn)證
                1.7.6 重組質(zhì)粒陽性模板標(biāo)準(zhǔn)的制備
                1.7.7 重組質(zhì)粒濃度的測(cè)定及計(jì)算
        2 三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立
            2.1 三重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件的優(yōu)化
            2.2 三重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.3 敏感性試驗(yàn)
            2.4 特異性試驗(yàn)
            2.5 重復(fù)性試驗(yàn)
        3 結(jié)果
            3.1 目的片段的PCR擴(kuò)增
            3.2 重組質(zhì)粒的制備和濃度測(cè)定
            3.3 Taqman法單項(xiàng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立
            3.4 Taqman法三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
                3.4.1 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件
                3.4.2 Taqman三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線
            3.5 敏感性試驗(yàn)
                3.5.1 普通PCR檢測(cè)豬鏈球菌2型敏感性試驗(yàn)
                3.5.2 三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)豬鏈球菌2型敏感性試驗(yàn)
            3.6 三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)豬鏈球菌2型的特異性
            3.7 三重?zé)晒舛縋CR的重復(fù)性試驗(yàn)
        4 討論
    第三章 豬鏈球菌選擇性增菌液的研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 菌株
                1.1.1 受試菌株
                1.1.2 其他菌株
            1.2 培養(yǎng)基
            1.3 抗生素藥敏紙片
            1.4 抗生素添加劑
            1.5 麥?zhǔn)媳葷峁?br>        2 方法
            2.1 抗菌藥物敏感試驗(yàn)
            2.2 抗菌藥物最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定
            2.3 抗菌藥物對(duì)其他菌的抑制情況
            2.4 組合抗菌藥物添加培養(yǎng)基的效果
            2.5 模擬污染樣本分離豬鏈球菌情況的初步比較
        3 結(jié)果
            3.1 豬鏈球菌2型對(duì)部分抗菌藥物的敏感性
            3.2 抗菌藥物最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定
            3.3 抗菌藥物對(duì)其他菌的抑制情況
            3.4 組合抗菌藥物添加培養(yǎng)基的效果
            3.5 模擬污染樣本分離豬鏈球菌情況的初步比較
        4 討論
    第四章 上海部分地區(qū)臨床表觀健康豬群豬鏈球菌攜帶情況的檢測(cè)
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 參考菌株及培養(yǎng)條件
            1.2 所用試劑,儀器和設(shè)備
                1.2.1 試劑
                1.2.2 儀器設(shè)備
            1.3 引物合成
        2 樣品處理
            2.1 樣品的采集
            2.2 樣品的均質(zhì)、增菌和分離
            2.3 模板的制備
            2.4 常規(guī)方法初步鑒定
            2.5 豬鏈球菌菌株型鑒定
            2.6 豬鏈球菌2型毒力因子檢測(cè)
        3 結(jié)果
            3.1 豬鏈球菌形態(tài)學(xué)觀察
            3.2 豬鏈球菌革蘭氏染色觀察
            3.3 淋巴結(jié)樣品中豬鏈球菌分布情況
            3.4 GDH陽性的豬鏈球菌2型毒力因子檢測(cè)結(jié)果
        4 討論
參考文獻(xiàn)
全文總結(jié)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[3]上海地區(qū)致病性豬鏈球菌及其毒力基因的檢測(cè)[D]. 李小軍.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[4]中國(guó)部分地區(qū)豬鏈球菌遺傳背景及進(jìn)化關(guān)系研究[D]. 蔡振鴻.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
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本文編號(hào)：2960019