發(fā)布時(shí)間：2020-12-21 07:27

　　豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是一種嚴(yán)重影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重要病原。非結(jié)構(gòu)蛋白9（nsp9）是PRRSV的RNA依賴(lài)的RNA聚合酶（RdRp）,參與形成病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體（RTC）,在病毒的復(fù)制調(diào)控和致病性方面具有重要的作用。迄今為止,PRRSVnsp9的生物學(xué)特性尚未完全闡明。本研究聚焦于分析PRRSVnsp9的組成、定位和與細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的關(guān)系及其潛在的復(fù)制非必需位點(diǎn),以期為進(jìn)一步闡明nsp9的功能提供科學(xué)依據(jù)。在PRRSV感染細(xì)胞中nsp9是否包含nsp8尚無(wú)定論。為了證實(shí)nsp8構(gòu)成nsp9的N端,經(jīng)表達(dá)和純化nsp8融合蛋白（GST-nsp8）,制備出兔源抗nsp8多克隆抗體（多抗）,并利用nsp9和nsp10單克隆抗體（單抗）、nsp7和nsp9多抗,采用免疫沉淀技術(shù)鑒定nsp9的分子大小。結(jié)果顯示,PRRSV感染細(xì)胞中的nsp9分子量介于72～95 kDa之間,且與體外表達(dá)的nsp8-90RF1b大小一致,但大于體外表達(dá)的nsp9ORF1b。同時(shí),nsp8多抗分別能夠檢測(cè)并通過(guò)免疫沉淀結(jié)合與nsp9大小一致的條帶,且經(jīng)質(zhì)譜分析其為包含nsp9ORF1b的肽段,而ns... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：138 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖２－１帶有同源臂的ＰＲＲＳＶ?ｎｓｐ８基因的擴(kuò)增??Ｆｉｇ．?２－１?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＰＲＲＳＶ?ＪＸｗｎ０６?ｎｓｐ８?ｇｅｎｅ?ｗｉｔｈ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ａｒｍｓ??

２５０?ｂｐ—??１００?ｂｐ—￣??圖２－１帶有同源臂的ＰＲＲＳＶ?ｎｓｐ８基因的擴(kuò)增??Ｆｉｇ．?２－１?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＰＲＲＳＶ?ＪＸｗｎ０６?ｎｓｐ８?ｇｅｎｅ?ｗｉｔｈ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ａｒｍｓ??２．３．２?ＧＳＴ－ｎｓｐ８蛋白的表達(dá)、純化與鑒定??將ｐＧＳＴ－ｎｓｐ８轉(zhuǎn)化￡ｃｏ／ｚ＿?ＢＬ－２１感受態(tài)細(xì)胞，用不同濃度ＩＰＴＧ誘導(dǎo)后，采用??ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，用０．１?ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ誘導(dǎo)后，用Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ??Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ？４Ｂ進(jìn)行純化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測(cè)，表達(dá)的ＧＳＴ－ｎｓｐ８融合蛋白呈單一條帶，??大小約為３１?ｋＤａ?（圖２－２Ａ）。用ＧＳＴ單抗進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ鑒定結(jié)果顯示，純化的蛋．??白能夠與ＧＳＴ單抗特異性反應(yīng)（圖２－２Ｂ）。??Ａ．?＂〉ＶＶ／Ｖ?Ｂ．??ｋＤａ?之?、氣?殳心?ｋＤａ?Ｃ？??７５＿Ｕｊ｜Ｐ?獅一＊?私１丨和＊ｆ、？一Ｉ?７５?—??％—’ｓｓｓ?＊袋?‘?６０—??＇?４５－??３５?—Ｈ

?第二章豬繁殖與呼吸綜合征病毒ｎｓｐ８構(gòu)成ｎｓｐ９Ｎ端的鑒定??ｒａｂｂｉｔ?ａｎｔｉ?ＧＳＴ－ｎｓｐ８?ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ｗｉｔｈ?ｎｓｐ８?ｉｎ?ＰＲＲＳＶ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ＭＡＲＣ－１４５?ｃｅｌｌｓ．??結(jié)果（圖２－３）顯示，在以ＨＡ單抗染色的細(xì)胞中，ＨＡ－ｎｓＰ８呈均質(zhì)分布于整個(gè)??細(xì)胞中，且在細(xì)胞核中的分布多于細(xì)胞質(zhì)的分布（圖２－３Ａ，左）；以ｎｓｐ８多抗染色??的細(xì)胞中，ＨＡ－ｎｓｐ８在細(xì)胞中的分布與ＨＡ單抗染色的細(xì)胞相同（圖２－３Ａ，中）；在??ｐＣＭＶ－ＨＡ載體轉(zhuǎn)染的ＭＡＲＣ－１４５細(xì)胞中未觀察到特異性熒光染色（圖２－３Ａ，右）。??在以ｎｓｐ８多抗染色的ＰＲＲＳＶ感染ＭＡＲＣ－１４５細(xì)胞中，ｎｓｐ８陽(yáng)性信號(hào)分布于細(xì)胞核??周區(qū)域（圖２－３Ｂ，左），而以兔陰性血清染色的細(xì)胞中，未觀察到陽(yáng)性熒光信號(hào)（圖??２－３Ｂ，中）；在以ｎｓｐ８多抗染色的正常ＭＡＲＣ－１４５細(xì)胞中，未觀察到任何熒光信號(hào)??（圖２－３Ｂ，右）。以上結(jié)果說(shuō)明，制備的兔源抗ｎｓＰ８多抗可與轉(zhuǎn)染、感染細(xì)胞中的??ｎｓｐ８反應(yīng)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬繁殖與呼吸綜合征病毒類(lèi)NADC30株CHsx1401感染性克隆的構(gòu)建[J]. 卞婷,周磊,宋江偉,蓋新娜,郭鑫,韓軍,楊漢春.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(03)
[2]Critical role of cytochrome c1 and its cleavage in porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 4-induced cell apoptosis via interaction with nsp4[J]. ZHANG Feng,GAO Peng,GE Xin-na,ZHOU Lei,GUO Xin,YANG Han-chun.  Journal of Integrative Agriculture. 2017(11)
[3]豬繁殖與呼吸綜合征病毒的遺傳變異與演化[J]. 楊漢春,周磊.  生命科學(xué). 2016(03)



本文編號(hào)：2929450