小花棘豆Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌可合成苦馬豆（Swainsonine,SW）,SW是一種有毒的吲哚里西啶生物堿,牲畜過量采食含SW的小花棘豆會中毒,給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重的損失。真菌中SW合成代謝途徑尚未清晰,酵母氨酸還原酶是該途徑的關(guān)鍵酶之一,Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因（sac）在SW合成代謝途徑中起重要作用。課題組前期體外培養(yǎng)出小花棘豆野生型內(nèi)生真菌OW7.8,獲得了基因缺失突變株M1,并構(gòu)建了該基因功能互補載體（pBARGPE-Sac）。本研究以小花棘豆Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌野生株OW7.8和酵母氨酸還原酶基因缺失突變株M1為研究對象,在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)內(nèi)生真菌,提取菌絲及發(fā)酵液中的SW,利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）檢測SW含量;探索了不同培養(yǎng)時間下實驗組（添加酵母氨酸）和對照組（不添加）中SW合成動態(tài)變化,進行統(tǒng)計學(xué)分析;驗證sac互補載體后,將其轉(zhuǎn)化至M1的原生質(zhì)體,經(jīng)再生和抗性篩選得到sac基因功能互補株,利用PCR技術(shù)檢測其sac,用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測sac... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古師范大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
1 引言
    1.1 小花棘豆內(nèi)生真菌研究概況
    1.2 苦馬豆素
        1.2.1 SW的理化性質(zhì)
        1.2.2 SW的醫(yī)學(xué)價值
        1.2.3 酵母氨酸還原酶基因與SW的生物合成
    1.3 基因互補實驗
    1.4 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗菌株及載體
        2.1.2 試劑與藥品
            2.1.2.1 常用試劑
            2.1.2.2 常用溶液的配制
        2.1.3 引物
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
    2.2 研究方法
        2.2.1 液體培養(yǎng)基中內(nèi)生真菌菌絲及其發(fā)酵液中SW含量測定
            2.2.1.1 內(nèi)生真菌的培養(yǎng)
            2.2.1.2 SW的提取
            2.2.1.3 SW含量的測定
        2.2.2 酵母氨酸還原酶基因功能對內(nèi)生真菌SW合成動態(tài)的影響..
        2.2.3 酵母氨酸還原酶基因功能互補株的構(gòu)建
            2.2.3.1 互補載體（pBARGPE-Sac）的驗證
            2.2.3.2 缺失突變株M1原生質(zhì)體制備與互補載體的轉(zhuǎn)化
        2.2.4 酵母氨酸還原酶基因功能互補株的檢測
            2.2.4.1 互補株sac的PCR檢測
            2.2.4.2 互補株總RNA的提取
            2.2.4.3 互補株cDNA合成
            2.2.4.4 sac基因RT-PCR檢測
            2.2.4.5 hph基因RT-PCR檢測
        2.2.5 互補株中SW含量的檢測
3 結(jié)果與分析
    3.1 液體培養(yǎng)基中菌絲及其發(fā)酵液中SW含量的測定
    3.2 酵母氨酸還原酶對內(nèi)生真菌SW動態(tài)合成的影響
        3.2.1 內(nèi)生真菌SW含量測定
        3.2.2 內(nèi)生真菌中SW合成動態(tài)變化的統(tǒng)計學(xué)分析
    3.3 酵母氨酸還原酶基因功能互補株的構(gòu)建
        3.3.1 sac功能互補載體（pBARGPE-Sac）的驗證
        3.3.2 缺失突變株原生質(zhì)體的制備與載體pBARGPE-Sac的轉(zhuǎn)化
        3.3.3 酵母氨酸還原酶基因功能互補株的檢測
            3.3.3.1 互補株sac的PCR檢測
            3.3.3.2 總RNA的提取
            3.3.3.3 互補株sac的RT-PCR檢測
            3.3.3.4 互補株hph的RT-PCR檢測
        3.3.4 互補株、OW7.8和M1中SW含量檢測
4 討論與結(jié)論
    4.1 討論
        4.1.1 液體培養(yǎng)基菌絲體及其發(fā)酵液中SW含量
        4.1.2 酵母氨酸對內(nèi)生真菌SW合成動態(tài)影響
        4.1.3 酵母氨酸還原酶基因功能互補株的構(gòu)建與驗證
    4.2 結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡介
資助項目


【參考文獻】：
期刊論文
[1]瘋草內(nèi)生真菌研究進展[J]. 梁妍,宋向東,謝宗秀,劉宇,郝寶成,王震,王保海,梁劍平.  動物醫(yī)學(xué)進展. 2020(09)



本文編號：2925112