柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）是一種寄生于雞盲腸的單細胞寄生原蟲,是雞球蟲病的主要病原體,目前國內外對雞球蟲病的防治主要依靠藥物。長期使用藥物使其對藥物表現出嚴重的抗性,給禽類的養(yǎng)殖帶來了大量的經濟損失。為研究雞球蟲耐藥性產生的機制,本實驗室前期以柔嫩艾美耳球蟲的藥物敏感株（DS）為親本,誘導出抗地克珠利耐藥株（DZR）和抗馬杜拉霉素耐藥株（MRR）。對2個耐藥株和敏感株進行轉錄組測序,篩選了敏感株與耐藥株的差異表達基因。在此基礎上,本研究選擇4個在耐藥株體內顯著上調的基因,分別為柔嫩艾美耳球蟲含HD域蛋白（HD domain-containing protein,EtHDCP）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,EtGAPDH）、伴侶蛋白TCP-1環(huán)狀復合物亞基α（T-complex protein 1 subunitα,EtTCP-1α）和蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase,EtMDH）。對這4個基因進行特性和功能的初步分析,并用全基因組重測序的方法對敏感株和2個耐藥株進行測... 

【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市

【文章頁數】：93 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

純化的柔嫩艾美耳球蟲4個階段蟲體Fig.2.1Purified4developmentalstagesofEimeriatenellaA：孢子化卵囊（×200）；B：未孢子化卵囊（×200）；C：子孢子（×200）；D：裂殖子（×400）

經凝膠電泳分析其完整性（圖2.2），可見提取的總 RNA 具有典型的 3 個條帶，表明提取的 RNA 未被降解，完整性較好。分光光度計檢測結果 OD260/OD280=1.93，表明 RNA 未被蛋白質和 DNA 污染，可進行下一步的反轉錄，用反轉錄 M-MLV 試劑盒，得到柔嫩美耳球蟲孢子化卵囊的 cDNA 第一鏈，保存于-20℃。

中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第二章 4 個耐藥相關基因的克隆和生物信息學分析因的 cDNA 片段。2.3.3.4 EtMDH 基因的 ORF 克隆根據 EtMDH 基因 ORF 序列，設計特異性引物，以柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊 cDNA 為模板，設定合適的退火溫度進行 PCR 擴增。瓊脂糖凝膠電泳對產物進行分析，可以發(fā)現在 954 bp處有特異性的單一條帶（圖 2.3D），與預期條帶位置相符；將條帶位置正確的 PCR 產物切下，用膠回收試劑盒對 PCR 產物進行回收。純化后的 PCR 產物與 pGEM-T-easy 載體 4℃條件下連接 8h 后，將連接產物轉入大腸桿菌 TOP10 感受態(tài)細胞中，在 LB 固體平板中挑取陽性菌落進行培養(yǎng)，并用 PCR 對菌液進行鑒定和測序。測序結果與原序列比對正確，表明成功擴增獲得 EtMDH 基因的 cDNA 片段。

【參考文獻】：
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