埃博拉出血熱（Ebola Hemorrhagic Fever,EHF）是由埃博拉病毒引起的能夠感染人類及其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物的高度接觸性傳染病,其主要癥狀為高熱、出血,死亡率高達(dá)90%。埃博拉病毒（Ebola virus,EBOV）屬于絲狀病毒科絲狀病毒屬的成員,為單股、負(fù)鏈、有囊膜的RNA病毒。其表面的囊膜糖蛋白GP是高度糖基化的蛋白,在介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)等過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用。分子伴侶鈣連蛋白（CNX）、鈣網(wǎng)蛋白（CRT）是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一類分子,能夠介導(dǎo)糖蛋白的加工和成熟過(guò)程。為了研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶CNX、CRT輔助埃博拉病毒囊膜糖蛋白成熟的機(jī)制,本試驗(yàn)首先利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了CNX、CRT基因敲除的293T細(xì)胞系。將表達(dá)埃博拉病毒囊膜蛋白GP mucin區(qū)域缺失基因（GP△MLD）的重組質(zhì)粒,與囊膜蛋白缺失、表達(dá)熒光素酶（Luc）的人免疫缺陷病病毒I型（HIV-1）基因組的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞（293T）,以包裝整合含有埃博拉病毒囊膜蛋白的偽型EBOV病毒。在293T野生型（WT）、CNX KO、CRT KO、CNX/CRT D.KO的... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：59 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 埃博拉病毒概述
        1.1.1 埃博拉出血熱的流行病學(xué)
        1.1.2 埃博拉病毒的分類和形態(tài)結(jié)構(gòu)
        1.1.3 埃博拉病毒的基因組結(jié)構(gòu)及功能
    1.2 CNX、CRT蛋白的結(jié)構(gòu)和功能
        1.2.1 CNX、CRT的結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)
        1.2.2 CNX、CRT的功能研究
        1.2.3 CNX、CRT與病毒相互作用的研究進(jìn)展
    1.3 CRISPR/Cas9技術(shù)
    1.4 本研究的目的和意義
第二章 利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建CNX/CRT D.KO的細(xì)胞系
    2.1 材料和方法
        2.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑和抗體
        2.1.3 主要的儀器設(shè)備
        2.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)基
        2.1.5 蛋白免疫印跡（Western blot）所用試劑及溶液
        2.1.6 Western blot檢測(cè)
        2.1.7 CNX gRNA引物的設(shè)計(jì)和質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.1.8 CNX基因敲除單克隆細(xì)胞株的篩選及序列分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 CNX基因敲除gRNA的構(gòu)建
        2.2.2 CNX gRNA轉(zhuǎn)染 48 h后的熒光檢測(cè)
        2.2.3 CNX基因缺失后在CRT KO細(xì)胞中的表達(dá)
        2.2.4 CNX基因缺失后基因測(cè)序
    2.3 討論
第三章 CNX、CRT對(duì)GP蛋白成熟機(jī)制的研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑和抗體
        3.1.3 主要的儀器設(shè)備
        3.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)基
        3.1.5 GP蛋白在CNX、CRT敲除細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)和偽病毒組裝
        3.1.6 CNX、CRT過(guò)表達(dá)對(duì)埃博拉病毒囊膜糖蛋白表達(dá)的影響
        3.1.7 內(nèi)源性CNX與GP之間的相互作用研究
        3.1.8 外源性CRT與GP之間的相互作用研究
        3.1.9 EBOV GP編碼基因糖基化位點(diǎn)的突變
        3.1.10 含糖基化位點(diǎn)突變的GP基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和重組假病毒的包裝
        3.1.11 含糖基化位點(diǎn)突變的GP基因包裝假病毒的感染力比較分析
        3.1.12 外源性CNX與糖鏈組合缺失GP蛋白相互作用的研究
        3.1.13 內(nèi)源性CRT與糖鏈缺失GP蛋白相互作用的研究
        3.1.14 Endo H酶對(duì)GP糖鏈組合缺失突變體的消化差異分析
        3.1.15 CNX、CRT蛋白對(duì)EBOV全長(zhǎng)GP蛋白表達(dá)及病毒組裝能力的影響
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 CNX、CRT蛋白缺失抑制了EBOV GP蛋白表達(dá)和偽病毒組裝
        3.2.2 CNX、CRT過(guò)表達(dá)對(duì)埃博拉病毒囊膜糖蛋白表達(dá)的影響
        3.2.3 內(nèi)源性CNX與GP之間存在相互作用
        3.2.4 外源性CRT與GP之間存在相互作用
        3.2.5 EBOV GP編碼基因糖基化位點(diǎn)的突變
        3.2.6 GP蛋白單點(diǎn)糖鏈缺失對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)和病毒組裝的影響
        3.2.7 GP蛋白N-端糖鏈依次缺失對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)和病毒組裝的影響
        3.2.8 GP蛋白糖鏈組合缺失后對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)和病毒組裝的影響
        3.2.9 GP蛋白糖鏈組合缺失包裝偽病毒的感染差異
        3.2.10 外源性CNX與糖鏈組合缺失GP蛋白相互作用的研究
        3.2.11 內(nèi)源性CRT與糖鏈組合缺失GP蛋白相互作用的研究
        3.2.12 Endo H酶對(duì)GP糖鏈組合缺失突變體的消化差異分析
        3.2.13 CNX、CRT蛋白對(duì)EBOV全長(zhǎng)GP蛋白表達(dá)及病毒組裝能力的影響
    3.3 討論
第四章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：2906663