A型流感病毒（Influenza A Virus,IAV）廣泛感染禽類與哺乳動物,而B型流感病毒只感染人類�；诓《颈砻嫣堑鞍籽兀℉A）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的不同組合,IAV可以進(jìn)一步分為多種亞型。目前為止,共鑒定出17種HA和10種NA。其中一些重組的IAV基因型（包括H5N1,H9N2,H7N2和H6N5）會引起人類的致命性感染。自噬是細(xì)胞對受損細(xì)胞器,廢舊蛋白和入侵微生物進(jìn)行吞噬降解和再利用的過程,已有越來越多的自噬相關(guān)蛋白被發(fā)現(xiàn)參與自噬的形成。自噬由液泡排列相關(guān)蛋白34（VPS34）活化引起,VPS34是種已知的III型磷脂酰肌醇激酶（PI3K-III）,其磷酸化底物磷脂酰肌醇（PI3P）可以和Beclin-1,ATG14L,VSP15組成蛋白復(fù)合物,為自噬小體形成所必需。ULK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,可以與自噬相關(guān)蛋白13（ATG13）和分子量大小為200kD的黏著斑激酶家族相互作用蛋白（FIP200）相互作用。VPS34由ULK1激活,激活后PI-4,5將會被催化成PI3P,活化的蛋白復(fù)合物將用于參與自噬雙層膜的形成并延長形成自噬體。ULK1的活性受哺乳動物雷帕霉素... 

【文章來源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．?ＩＡＶ在ＣＥＦ和ＤＦ１細(xì)胞中誘導(dǎo)ＬＣ－３脂質(zhì)化和ｐ６２降解

??接下來，我們用共聚焦顯微鏡檢測來觀察三種不同的ＩＡＶ病毒是否也差異性誘導(dǎo)自噻??小體的形成。如圖２Ｂ所示，Ｈ５Ｎ１誘導(dǎo)的自噬小體成核周分布，和陽性對照雷帕霉素誘導(dǎo)??的細(xì)胞自噬相似。而Ｈ１Ｎ１誘導(dǎo)的自噬小體非常大聚集分布在核的一邊。Ｈ９Ｎ２病毒誘導(dǎo)??的自噻小體大多分布在細(xì)胞核附近一側(cè)。三種亞型ＩＡＶ病毒均能誘導(dǎo)３０％左右的細(xì)胞量產(chǎn)??生自噬，陽性對照雷帕霉素能誘導(dǎo)１５％左右的細(xì)胞產(chǎn)生自嗤（圖２Ｃ）。??Ａ?Ｂ??ＤＡＰＩ?ＧＦＰ－ＬＣ３?Ｍｅｒｇｅ??則：＇??圖２．三種亞型流感病毒差異性誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。（Ａ）不同ＩＡＶ亞型（Ｈ５Ｎ１，?Ｈ９Ｎ２，?Ｈ１Ｎ１）用指定濃??度感染０￡？細(xì)胞２４小時。裂解細(xì)胞后用＾＾５１６１１１８１〇１檢測１￡：３－１１，？６２，＾１１，及＾－３（：１；：１１１的蛋白表達(dá)水??平。（Ｂ）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)ｐｍＬＣ３－ＧＦＰ的ＤＦ－１細(xì)胞分別感染Ｈ５Ｎ１?（０．１?ＭＯＩ），?Ｈ９Ｎ２?（１?ＭＯＩ）和Ｈ〗Ｎ１?（１??ＭＯＩ）。雷帕霉素（５０ｎＭ）作用未感染細(xì)胞作為陽性對照。藥物作用或病毒感染１２小時后，在共聚焦??顯微鏡下觀察自噬小體。比例尺，２５ｐｍ。計算產(chǎn)生自噬小體的ＧＲＰ陽性表達(dá)的ＤＦ１細(xì)胞比例，并繪制??條形圖。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。??

ａｎｄ?ｐｌｏｔｔｅｄ?ｉｎ?ａ?ｂａｒ?ｇｒａｐｈ?ｗｉｔｈ?ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ?ａｎａｌｙｓｉｓ?（Ｃ）．?＊ｐ＜０．０５；?＊＊ｐ＜０．０１．??為了驗證Ｈ５Ｎ１病毒誘導(dǎo)細(xì)胞完全自噬的能力，我們分別用巴弗洛霉素Ａ（Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ??Ａ，Ｂａｆ）和氯唾（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ，ＣＱ）兩種自噬抑制劑來阻斷自噬流的形成。；碑過圖３Ａ＆Ｂ??可以發(fā)現(xiàn)，ＣＱ和Ｂａｆ增強(qiáng)了?Ｈ５Ｎ１誘導(dǎo)的ＬＣ３－ＩＩ的增加，并阻斷了由Ｈ５Ｎ１誘導(dǎo)引起的??ｐ６２的降解。與此相反的是，ＣＱ和Ｂａｆ對Ｈ１Ｎ１感染細(xì)胞中的ｐ６２水平與ＬＣ３－ＩＩ的變化??幾乎沒有影響。ＤＦ１細(xì)胞感染Ｈ５Ｎ１病毒的熒光共聚焦結(jié)果同樣可以證明，Ｈ５Ｎ１誘導(dǎo)細(xì)??胞完全自噬。如圖３Ｃ所示，Ｂａｆ?（１０ｎＭ）或者Ｈ５Ｎ１病毒（０．１ＭＯＩ）可以顯著增加自噻??小體的形成，表現(xiàn)為ＧＦＰ－ＬＣ３熒光聚點的數(shù)量增加。ＤＦ１細(xì)胞感染Ｈ５Ｎ１病毒后加入Ｂａｆ??可以進(jìn)一步增加ＧＦＰ－ＬＣ３熒光聚點的數(shù)量（圖３Ｄ）。?備??我們接下來驗證是否阻斷了自噬會影響ＩＡＶ的胞內(nèi)復(fù)制。如圖３Ｅ所示，ＣＥＦ細(xì)胞感??染Ｈ５Ｎ１后加入Ｂａｆ，分別檢測胞內(nèi)病毒蛋白的含量和細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒蛋白的含量。??結(jié)果顯示


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