豬德爾塔冠狀病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是近年來新發(fā)現(xiàn)的腸道致病性冠狀病毒。仔豬感染PDCoV后出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和脫水等癥狀,有較高的發(fā)病率和死亡率,是導致仔豬死亡的重要原因之一。目前,在多個國家和地區(qū)都檢測到了 PDCoV,在國內多個省份也有該病毒的相關報道。鑒于PDCoV在豬群中的廣泛流行性及潛在威脅,本研究建立了檢測PDCoV抗體的間接ELISA方法和細胞免疫組化法,以及檢測PDCoV抗原的雙抗體夾心ELISA方法。1.檢測PDCoV抗體的間接ELISA方法的建立本研究通過DNAStar Protean軟件對PDCoV N蛋白氨基酸序列進行分析,選取抗原性較強的區(qū)段(265～342 aa),根據大腸桿菌密碼子使用的偏嗜性進行優(yōu)化設計并人工合成了對應的基因片段N-Opti。分別利用pET-32a和pGEX-6p-1表達系統(tǒng)進行原核表達,獲得的兩種融合蛋白分別帶有His和GST標簽,命名為PDCoV-N-His和PDCoV-N-GST,且均呈可溶性表達。Western Blot鑒定結果顯示兩個重組蛋白大小均與預期相符,分別約為31 kDa 和 36 kDa。利用Ni-NTA親和層析介質和高親和力GST純化介質,分別純化出兩種重組蛋白作為包被抗原進行ELISA檢測,經比較,以PDCoV-N-His作為包被抗原檢測效果更好。最終以PDCoV-N-His作為包被抗原建立了檢測PDCoV特異性抗體的間接ELISA方法。經測定,該方法具有良好的特異性且重復性良好,與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(PRoV)特異性陽性血清無交叉反應,批內和批間重復性試驗的變異系數均小于10%。應用該方法對20份己知陽性血清和20份陰性血清分別進行檢測,結果顯示陽性符合率為100%(20/20),陰性符合率為100%(20/20),表明方法的特異性良好,可以進一步用于PDCoV感染的快速診斷和流行病學調查。2.檢測PDCoV抗體的細胞免疫組化法的建立根據完整PDCoV N基因序列設計引物,利用RT-PCR方法克隆N基因,進而構建表達N蛋白的慢病毒載體。以包裝的慢病毒感染Vero細胞,通過4μg/mL的嗓呤霉素篩選,獲得穩(wěn)定表達N蛋白的重組細胞系Vero/PDCoV-N。經Western Blot鑒定,該細胞系能表達與預期大小相符的41 kDa的蛋白條帶。應用該細胞系進一步建立了檢測PDCoV特異性抗體的細胞免疫組化檢測方法。應用該方法檢測已知PDCoV陽性血清,顯色后細胞質呈現(xiàn)特異性棕褐色,而作為對照的Vero細胞無任何顏色反應。該方法的建立為PDCoV感染的快速診斷和流行病學調查提供了另外一種有效的血清學檢測方法。3.檢測PDCoV抗原的雙單抗夾心ELISA方法的建立本研究以PDCoV-N-His蛋白為免疫原,以PDCoV-N-GST蛋白為檢測抗原,采用雜交瘤技術,經ELISA篩選獲得了 6株能穩(wěn)定分泌針對PDCoVN蛋白單抗的雜交瘤細胞株,分別命名為1A2、4C5、5C5、8C12、8E8、10A7。亞類鑒定結果顯示,在6株單抗中,4株為IgGi亞型,2株為IgM亞型。對6株單抗的相對親和力和抗原結合表位進行綜合分析,選擇1A2為捕獲抗體,HRP偶聯(lián)的5C5為檢測抗體,建立了雙抗體夾心ELISA方法。該方法的雙對數回歸擬合線線性相關系數大于0.99,通過回歸方程確定定量分析PDCoVN蛋白的檢測范圍為80 ng/mL～1.3μg/mL。批間和批內重復性試驗的變異系數均小于10%,表明方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。本研究建立的雙單抗夾心ELISA方法展示出對重組N蛋白的良好檢測效果,有望以此為基礎進一步開發(fā)出可用于臨床PDCoV感染診斷的特異性抗原檢測方法。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

部分ＰＤＣｏＶ陽性樣品感染ＰＥＤＶ［５Ｑ，５Ｉ］。為應對ＰＤＣｏＶ對美國豬群的影響，２０１４年６月５??日美國農業(yè)部頒布了一項法令，要求及時上報所有的豬腹瀉病例［５１】。隨后ＰＤＣｏＶ在加拿??大［５２】、泰國［５３］、韓國１５４］、日本［５５］、越南［５６］、中國［５７，５８］等地均有出現(xiàn)和報道（圖１．３），呈現(xiàn)??全球流行的趨勢。??戰(zhàn)??圖１．３?ＰＤＣｏＶ世界分布圖［５９】??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｗｏｒｌｄ?ｗｉｔｈ?ｓｗｉｎｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｆｏｒ?ｐｏｒｃｉｎｅ?ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ??自２０１２年在香港地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)ＰＤＣｏＶ以來，中國其他地區(qū)不斷出現(xiàn)了?ｒｏＣｏＶ的相??關報道。２０１２年下半年，中國西部四川地區(qū)檢測到ＰＤＣｏＶ＿；?２０１５年，ＳＵ等［６１】對黑龍??江地區(qū)的３１９份豬腹瀉病料進行檢測，ＰＤＣｏＶ陽性率為１１．５９?（３７／３１９）；?２０１５年，對中國??南部部分省份地區(qū)的哺乳仔豬進行檢測，整體發(fā)病率僅１．２８％，雖然檢出率較低，但幾乎??每個省份都有ＰＤＣｏＶ檢出〖６義２０１６年，天津某豬場出現(xiàn)仔豬腹瀉，趙峰等［５７］從該豬場發(fā)??病仔豬糞便中檢測到ＰＤＣｏＶ，命名為ＣＨＮ／Ｔｉａｎｊｉｎ／２０１６，經全基因測序分析其核苷酸序列??與中國流行株（ＧｅｎＢａｎｋ?登錄號：ＫＰ７５７８９２，?ＫＰ７５７８９１，?ＫＲ１３１６２１，ＫＴ２６６８２２?和?ＪＱ０６５０４３??等）和某些美國流行株（ＧｅｎＢａｎｋ?登錄號：ＫＪ７６９２３１

部分ＰＤＣｏＶ陽性樣品感染ＰＥＤＶ［５Ｑ，５Ｉ］。為應對ＰＤＣｏＶ對美國豬群的影響，２０１４年６月５??日美國農業(yè)部頒布了一項法令，要求及時上報所有的豬腹瀉病例［５１】。隨后ＰＤＣｏＶ在加拿??大［５２】、泰國［５３］、韓國１５４］、日本［５５］、越南［５６］、中國［５７，５８］等地均有出現(xiàn)和報道（圖１．３），呈現(xiàn)??全球流行的趨勢。??戰(zhàn)??圖１．３?ＰＤＣｏＶ世界分布圖［５９】??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｗｏｒｌｄ?ｗｉｔｈ?ｓｗｉｎｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｆｏｒ?ｐｏｒｃｉｎｅ?ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ??自２０１２年在香港地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)ＰＤＣｏＶ以來，中國其他地區(qū)不斷出現(xiàn)了?ｒｏＣｏＶ的相??關報道。２０１２年下半年，中國西部四川地區(qū)檢測到ＰＤＣｏＶ＿；?２０１５年，ＳＵ等［６１】對黑龍??江地區(qū)的３１９份豬腹瀉病料進行檢測，ＰＤＣｏＶ陽性率為１１．５９?（３７／３１９）；?２０１５年，對中國??南部部分省份地區(qū)的哺乳仔豬進行檢測，整體發(fā)病率僅１．２８％，雖然檢出率較低，但幾乎??每個省份都有ＰＤＣｏＶ檢出〖６義２０１６年，天津某豬場出現(xiàn)仔豬腹瀉，趙峰等［５７］從該豬場發(fā)??病仔豬糞便中檢測到ＰＤＣｏＶ，命名為ＣＨＮ／Ｔｉａｎｊｉｎ／２０１６，經全基因測序分析其核苷酸序列??與中國流行株（ＧｅｎＢａｎｋ?登錄號：ＫＰ７５７８９２，?ＫＰ７５７８９１，?ＫＲ１３１６２１，ＫＴ２６６８２２?和?ＪＱ０６５０４３??等）和某些美國流行株（ＧｅｎＢａｎｋ?登錄號：ＫＪ７６９２３１

智能生化培養(yǎng)箱?常州恒隆儀器有限公司??電子天平?上海越平科學儀器有限公司??法??ＤＣｏＶＮ蛋白的原核表達???ＰＤＣｏＶＮ蛋白原核表達質粒的構建??過ＤＮＡＳｔａｒＰｒｏｔｅａｎ軟件，對本實驗室測定的ＰＤＣｏＶＣＨＮ／Ｔｉａｎｊｉｎ／２０１６株列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號：ＫＹ０６５１２０）進行分析，挑選其中抗原性較好的一），根據大腸桿菌密碼子使用的偏嗜性規(guī)律，對其基因片段進行密碼子優(yōu)化隆，基因片段兩端分別加上Ｉ和說〇?Ｉ限制性內切酶識別位點，優(yōu)０＾／委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行合成。利用限制性內切酶將人工合成的Ｎ基因片段定向克隆入原核表達載體ｐＥＴ－３２ａ和ｐＧＥＸ－６ｐ－，獲得重組質粒?ｐＥＴ－３２ａ－ＰＤＣｏＶ－Ｎ－Ｏｐｔｉ?和?ｐＧＥＸ－６ｐ－ｌ－ＰＤＣｏＶ－Ｎ－Ｏｐｔｉ，如Ａ?＾＾ＴＯＣｏＶ－ＮＪＪｐｔｉ?Ｂ?ｕｃｐｒｏｍ？？??
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本文編號：2887460