牛支原體是導(dǎo)致牛支原體病的病原體,主要引起牛呼吸綜合征、關(guān)節(jié)炎及奶牛乳腺炎等多種疾病。病原分泌蛋白直接參與病原體和宿主的信息交流,是病原體發(fā)揮致病和免疫作用的重要組分,可望作為藥物和疫苗的潛在靶標(biāo)。然而牛支原體分泌蛋白研究剛剛起步,已鑒定的分泌蛋白很少,其在致病與免疫中的作用有待研究。本研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)以及生物信息學(xué)分析,尋找牛支原體強(qiáng)弱菌株具有功能的分泌蛋白,為牛支原體致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。取得如下結(jié)果:1.以牛支原體強(qiáng)毒株HB0801和其傳代150代的弱毒株為研究對象,通過摸索適合的無血清培養(yǎng)基,建立牛支原體分泌蛋白的提取方法,利用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2-D)和非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)(Label-Free)分離、鑒定并量化牛支原體強(qiáng)弱菌株分泌蛋白的表達(dá)情況,對8個(gè)分泌蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步分析。利用蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析,共鑒定牛支原體分泌蛋白548個(gè),有效的分泌蛋白477個(gè),理論分子量介于10kDa-90kDa。其中較牛支原體弱毒株P(guān)150,牛支原體強(qiáng)毒株P(guān)1上調(diào)的分泌蛋白有66個(gè),下調(diào)的分泌蛋白有48個(gè);46個(gè)分泌蛋白只在P1中鑒定到,5個(gè)分泌蛋白只在P150中鑒定到。對鑒定出的牛支原體強(qiáng)弱菌株分泌蛋白進(jìn)行KEGG通路分析和GO富集分析,發(fā)現(xiàn)牛支原體強(qiáng)毒株P(guān)1的分泌蛋白較弱毒株P(guān)150在以下蛋白質(zhì)富集度具有顯著性差異:生物過程(Biological Process)中,核糖核蛋白復(fù)合物的生物合成(Ribonucleoprotein Complex Biogenesis)、核糖體合成(Ribosome Biogenesis)、細(xì)胞對DNA損傷反應(yīng)(Cellular Response to DNA Damage Stimulus)、DNA修復(fù)(DNA Repair)、細(xì)胞成分生物合成(Cellular Component Biogenesis)和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)(Cellular Response to Stress);在細(xì)胞組分(Cellular Component)中,胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物(Intracellular Ribonucleoprotein Complex)和核糖核蛋白復(fù)合物(Ribonucleoprotein Complex);在分子功能(Molecular Function)中,結(jié)構(gòu)分子活性(Structural Molecule Activity)和組成核糖體結(jié)構(gòu)(Structural Constituent of Ribosome)。牛支原體弱毒株P(guān)150分泌蛋白受到顯著性影響的通路為核糖體(Ribosome)和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Phosphotransferase System)。通過亞細(xì)胞定位和分泌類型預(yù)測,發(fā)現(xiàn)有15個(gè)分泌蛋白定位于外膜(Outer Membrane),2個(gè)分泌蛋白在胞外(Extracellular);65個(gè)分泌蛋白是非經(jīng)典型(Non-classical)分泌類型,而有53個(gè)分泌蛋白是經(jīng)典型(Classical)分泌類型。2.選取了8個(gè)的分泌蛋白MbovP103(PDHB)、MbovP145、MbovP174、MbovP339(VspY1)、MbovP481(EF-Tu)、MbovP676(EF-G)、MbovP725、MbovP796作為研究對象,對這些分泌蛋白進(jìn)行克隆表達(dá)、多克隆抗體血清的制備,并驗(yàn)證了它們的免疫原性。另外,在探究分泌蛋白炎性反應(yīng)的功能中,發(fā)現(xiàn)分泌蛋白rMbovP339蛋白能夠促進(jìn)牛巨噬細(xì)胞BoMac的炎性反應(yīng)。利用本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的牛支原體轉(zhuǎn)座子突變體庫篩選得到rMbovP339的突變菌株,在感染比為1000的條件下刺激牛巨噬細(xì)胞BoMac 12h后,發(fā)現(xiàn)其促炎因子IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著降低;同時(shí),將去除內(nèi)毒素的rMbovP339蛋白(10μg)刺激BoMac 12h后,促炎因子IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著升高,IL-1β和IL-6證明了Mbov-0339基因表達(dá)的蛋白具有促進(jìn)炎性反應(yīng)的作用。綜上所述,本研究應(yīng)用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)(Label-Free)方法對牛支原體強(qiáng)弱菌株的分泌蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離和鑒定,初步揭示了牛支原體強(qiáng)弱菌株分泌蛋白組及其差異蛋白。對8種分泌蛋白進(jìn)行原核表達(dá)和多克隆抗體制備及生物功能探究,發(fā)現(xiàn)重組蛋白rMbovP339對牛巨噬細(xì)胞BoMac的炎性反應(yīng)具有促進(jìn)作用。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.62
【部分圖文】：

圖 2-1 牛支原體強(qiáng)弱菌株的鑒定。Fig. 2-1 Identification between Mycoplasma bovis P1 and P150（1: DL500; 2: blank; 3,4:P150; 5,6:P1）泌蛋白提取方法的建立菌株的生長曲線量，即牛支原體強(qiáng)毒株 P1(2.0×109CFU/mL,L, 1mL)，于 100mL 的 PPLO 液體培養(yǎng)基中培長趨勢相似，皆于 24h 左右到達(dá)平臺(tái)期。

圖 2-1 牛支原體強(qiáng)弱菌株的鑒定。Fig. 2-1 Identification between Mycoplasma bovis P1 and P150.（1: DL500; 2: blank; 3,4:P150; 5,6:P1）原體分泌蛋白提取方法的建立原體強(qiáng)弱菌株的生長曲線相同菌量，即牛支原體強(qiáng)毒株 P1(2.0×109CFU/mL, 1.3mL)和弱9CFU/mL, 1mL)，于 100mL 的 PPLO 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 48h，結(jié)果株的生長趨勢相似，皆于 24h 左右到達(dá)平臺(tái)期。140bp

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文選擇對數(shù)期 18h 時(shí)的牛支原體強(qiáng)弱菌株 1：100 接種于優(yōu)化的極限培養(yǎng)基 M9、A、M63、PBS 的中，通過計(jì)數(shù)的方法觀察其在以上培養(yǎng)基中的生長情況。牛支原體在 PBS、M9 優(yōu)化的培養(yǎng)基中較其他極限培養(yǎng)生存狀態(tài)更好，本實(shí)驗(yàn)選擇優(yōu)化的 PBS和 M9 培養(yǎng)基作為牛支原體無血清培養(yǎng)基孵育的前提提取牛支原體分泌蛋白。A B
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2886557