發(fā)布時間：2020-11-09 05:28

　　 近年來,豬流行性腹瀉病毒(PEDV)變異毒株引起的新型豬流行性腹瀉在世界范圍內(nèi)暴發(fā),給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。然而,當前防控手段的匱乏無法應(yīng)對PED帶來的威脅。因此,研究PEDV的致病機理以及開發(fā)抗PEDV藥物對PED的防控和治療具有深遠的意義。本研究基于iTRAQ技術(shù),開展了PEDV強毒株及其傳代致弱毒株感染仔豬空腸組織的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,為揭示PEDV的致病機理和宿主的免疫應(yīng)答提供參考。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果,研究了hnRNP A1和PEDV N蛋白的互作關(guān)系,為揭示PEDV的復(fù)制過程提供參考。研究了槲皮素的抗PEDV作用并闡明了其抗病毒機理,為PEDV的治療和相關(guān)藥物的開發(fā)提供了參考。主要研究內(nèi)容如下:1.PEDV強毒株及其致弱毒株感染仔豬空腸的蛋白質(zhì)組學(xué)分析本研究使用iTRAQ定量蛋白質(zhì)技術(shù)結(jié)合液相二級質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS),研究了PEDV強毒株及其傳代致弱毒株感染仔豬空腸的蛋白質(zhì)組學(xué)變化。在強毒株YN13株感染組和弱毒YN144感染組分別鑒定到269和301個差異表達蛋白。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),差異蛋白主要涉及應(yīng)激反應(yīng),信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)等過程。進一步分析發(fā)現(xiàn),PEDV感染可以導(dǎo)致多種干擾素刺激基因的上調(diào)表達,表明PEDV感染會誘導(dǎo)宿主的先天性免疫過程。通過對比分析兩感染組的蛋白,發(fā)現(xiàn)許多熱激蛋白家族成員和一些轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)因子在兩組中呈現(xiàn)不同的表達情況,提示這可能是造成兩毒株致病性差異的因素。2.核不均一蛋白A1(hnRNP A1)參與PEDV的復(fù)制過程根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)hnRNP A1在兩病毒感染組表現(xiàn)為不同的表達情況,提示該蛋白的變化可能會造成病毒致病力的變化。首先研究了該蛋白在細胞中定位情況,通過共聚焦試驗發(fā)現(xiàn)該蛋白和PEDV的N蛋白存在共定位,表明兩者之間存在互作關(guān)系。使用免疫共沉淀技術(shù),進一步確認了兩者之間的互作關(guān)系。hnRNP A1和PEDV N蛋白的定位區(qū)主要位于核周,而核周是冠狀病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體存在的位置,提示hnRNP A1可能參與了該復(fù)合體的組成,進而參與了PEDV的復(fù)制過程。為了驗證hnRNP A1是否參與了PEDV的復(fù)制過程,通過siRNA沉默hnRNP A1的表達,而后使用不同PEDV毒株感染。通過間接免疫熒光試驗、熒光定量RT-PCR和Western blot試驗發(fā)現(xiàn)hnRNP A1沉默后,PEDV的基因組、PEDV感染的細胞數(shù)量以及PEDV N蛋白的表達量都顯著減少,說明hnRNP A1參與了PEDV的復(fù)制過程。結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果,推測hnRNP A1在YN144感染組的下調(diào)表達是造成兩病毒毒力差異的原因之一。3.槲皮素抗PEDV研究通過間接免疫熒光和Western blot試驗,發(fā)現(xiàn)槲皮素可以有效抑制PEDV的感染過程。首先研究了槲皮素對PEDV吸附和入侵過程的影響,發(fā)現(xiàn)其并不能抑制PEDV吸附和入侵Vero細胞,表明槲皮素抗PEDV的作用發(fā)生在病毒入侵宿主細胞之后。由于槲皮素是一種很好的HSPA1抑制劑,其可能通過抑制HSPA1發(fā)揮抗PEDV效果。為驗證此設(shè)想,使用siRNA沉默HSPA1的表達,然后再感染PEDV,通過熒光定量RT-PCR、間接免疫熒光和Western blot試驗發(fā)現(xiàn)PEDV的感染過程并未受到影響。表明槲皮素的抗病毒效果并不依賴其HSPA1抑制劑的活性。通過Docking分析,發(fā)現(xiàn)槲皮素可以結(jié)合于PEDV 3C樣蛋白酶的活性位點,表明其可能抑制PEDV的3C蛋白酶活性。表達純化了PEDV的3C樣蛋白酶,通過表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)驗證了兩者可以發(fā)生互作。為驗證槲皮素是否可以抑制PEDV 3C樣蛋白酶的活性,建立了一種熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)方法,通過該方法發(fā)現(xiàn)純化的蛋白具有很好的酶活性,在酶反應(yīng)體系中加入槲皮素,發(fā)現(xiàn)PEDV3C樣蛋白酶的活性受到顯著抑制,而且抑制效果呈劑量依賴性。因此,認為槲皮素可以通過抑制PEDV 3C樣蛋白酶的活性而發(fā)揮抗PEDV效果。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S858.28
【部分圖文】：

iTRAQ技術(shù)流程

iTRAQ結(jié)構(gòu)

圖 1-5 槲皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig. 1-5 Structure of quercetin皮素抗病毒機制感染過程包括吸附、入侵、復(fù)制和釋放等過程。抑制病毒
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3 李鵬;吳夢郡;余魁;徐海旺;吳濤;易丹;王蕾;趙迪;侯永清;;幼齡仔豬PEDV感染腸道損傷模型的建立[J];中國畜牧獸醫(yī);2018年06期

4 丁尊俄;馮旭芳;張雙翔;何賢海;胡興義;張海;王開功;文明;程振濤;李晨;蒲翠敏;羅引幸;劉麗娟;周碧君;;貴州省PEDV與PoRV分子流行病學(xué)調(diào)查[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2018年06期

5 張丁華;王艷豐;;養(yǎng)豬場PEDV與其他腹瀉相關(guān)病毒共感染狀況及防控措施[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2018年14期

6 Wang Zhongze;Qin Cuili;Kong Ning;Zuo Yewen;Wang Meng;Zheng Hao;Tong Wu;Li Liwei;Yu Hai;Li Zhili;Shan Tongling;Tong Guangzhi;Li Xue;;Screening of Host Proteins Interacting with Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) N Protein by Yeast Two-hybrid System[J];Animal Husbandry and Feed Science;2018年04期

7 羅亞坤;梁琳;王靜;劉存;劉琪;劉暢;藺文成;崔尚金;;豬流行性腹瀉病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的建立及應(yīng)用[J];中國畜牧獸醫(yī);2017年02期

8 Qin Yibin;Lu Bingxia;Zhao Wu;He Ying;Li Yingying;Li Bin;Liang Jiaxing;Liang Baozhong;Su Qianlian;Jiang Dongfu;Zhou Yingning;;Development and Application of an RT-PCR Method for Differentiation of PEDV Variant Strains and Classical Strains[J];Animal Husbandry and Feed Science;2015年01期

9 李凱年;;證據(jù)表明在離被感染豬群較遠空氣中的PEDV也具有感染性[J];中國動物保健;2014年10期

10 李沛東;位玉玲;于少芳;鄭佳佳;李龍;;豬體內(nèi)PEDV病原含量與血清中PEDV抗體水平之間的關(guān)系初探[J];畜牧與獸醫(yī);2018年04期

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1 李中華;PEDV感染豬空腸組織的蛋白質(zhì)組學(xué)分析及hnRNP A1影響PEDV復(fù)制的作用機制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

2 周興東;在細胞超微結(jié)構(gòu)水平上研究氯喹及PEDV對自噬的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

3 王興葉;豬流行性腹瀉病毒高增殖Vero細胞選育、分離鑒定及致腸道靶細胞SIEC病理機制研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

4 趙鵬偉;豬流行性腹瀉病毒流行株的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

5 王翠玲;PEDV病毒樣顆粒的構(gòu)建與免疫原性研究[D];石河子大學(xué);2017年

6 曹麗艷;豬流行性腹瀉病毒感染豬小腸上皮細胞抑制IFN-β產(chǎn)生及激活NF-κB機理研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 孫瑞芹;華南地區(qū)豬流行性腹瀉病毒的分子流行病學(xué)與病原學(xué)研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

8 施雯;絲氨酸蛋白酶對豬流行性腹瀉病毒S蛋白的作用及其對病毒繁殖的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

9 葉十一;二維類石墨烯材料抗病毒機理研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

10 陳建飛;豬流行性腹瀉病毒全基因組序列分析及感染性cDNA克隆的構(gòu)建[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

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8 汪懌旸;致豬腹瀉病毒快速檢測方法研究及分子流行病學(xué)調(diào)查[D];揚州大學(xué);2018年

9 趙喜文;PEDV感染介導(dǎo)Vero E6細胞差異表達磷酸化蛋白篩選及功能解析[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2018年

10 王恩雨;2015-2016年中國豬流行性腹瀉病毒S1基因分子流行病學(xué)調(diào)查及病毒分離與鑒定[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2018年

本文編號：2875958