小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus,PPRV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。PPRV與其他麻疹病毒屬成員均對(duì)淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞具有較強(qiáng)嗜性。PPRV因其淋巴細(xì)胞嗜性導(dǎo)致機(jī)體在感染后表現(xiàn)出持久的免疫抑制�，F(xiàn)已證實(shí),信號(hào)淋巴細(xì)胞活化分子(Signaling lymphocyte activation molecule,SLAM),也稱(chēng)作CD150,是麻疹病毒屬M(fèi)V、CDV、RPV、PPRV在淋巴細(xì)胞的受體,可以在活化的以及記憶性的T細(xì)胞、B細(xì)胞,單核細(xì)胞,NKT細(xì)胞以及成熟的DC細(xì)胞中表達(dá)。因此,關(guān)于SLAM受體表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究對(duì)深入闡明PPRV對(duì)宿主動(dòng)物,特別在山羊等易感動(dòng)物的致病機(jī)制具有重要意義。近年來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)表明宿主細(xì)胞microRNA(miRNA)是宿主-病原體相互作用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中不可或缺的調(diào)節(jié)因子。本研究旨在探索PPRV體外感染山羊外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)后,細(xì)胞源miRNA調(diào)節(jié)SLAM受體的作用機(jī)制及其對(duì)PPRV復(fù)制的影響,獲得的主要研究結(jié)果如下:1)通過(guò)深度測(cè)序檢測(cè)PPRV N75-1疫苗株感染對(duì)山羊PBMCs中miRNA表達(dá)譜的影響發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比,PPRV感染PBMCs 24 h后能夠誘導(dǎo)316種顯著差異表達(dá)的miRNAs,其中包括103種已知miRNAs與213種未知的miRNAs。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行靶向基因預(yù)測(cè)及功能分析發(fā)現(xiàn),它們主要對(duì)細(xì)胞TLR信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞內(nèi)吞作用、病毒致癌作用以及JAK-STAT信號(hào)通路等有調(diào)控作用。2)PPRV感染山羊PBMCs引起細(xì)胞腫脹、聚集成團(tuán),隨著感染時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞病變程度漸進(jìn)性增強(qiáng)。以不同MOI(0.1、1、10)PPRV感染PBMCs,通過(guò)qRT-PCR及Western blot檢測(cè)miR-218及SLAM的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),miR-218和SLAM表達(dá)水平分別呈現(xiàn)病毒感染劑量依賴(lài)性的降低和升高。此外,miR-218表達(dá)隨PPRV感染時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(shì),SLAM mRNA及蛋白表達(dá)水平隨病毒感染時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后降低的變化趨勢(shì),表明PPRV感染山羊PBMCs中miR-218和SLAM表達(dá)水平始終呈負(fù)相關(guān)。為進(jìn)一步研究miR-218對(duì)PPRV感染山羊PBMCs中SLAM受體表達(dá)水平的調(diào)控作用,通過(guò)轉(zhuǎn)染不同劑量濃度的miR-218 mimic,miR-218 inhibitor及其相應(yīng)的Control序列發(fā)現(xiàn),miR-218對(duì)PPRV感染PBMCs中SLAM受體表達(dá)水平的負(fù)調(diào)控作用具有劑量依賴(lài)性。此外,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明miR-218可直接靶向SLAM基因的3'UTR。通過(guò)Western blot及ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染并接毒處理后山羊PBMCs中不同細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)及分泌水平,發(fā)現(xiàn)mi R-218通過(guò)調(diào)節(jié)SLAM通路介導(dǎo)的Th1型免疫反應(yīng)影響PPRV的復(fù)制水平。3)通過(guò)使用紫外滅活PPRV(UV-PPRV)感染山羊PBMCs,qRT-PCR、Western blot及流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PPRV的復(fù)制能力是影響miR-218介導(dǎo)SLAM表達(dá)水平調(diào)節(jié)的重要因素。綜上所述,本研究通過(guò)PPRV N75-1疫苗株感染山羊PBMCs,證實(shí)了細(xì)胞源miR-218對(duì)PPRV感染山羊PBMCs中SLAM受體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控作用及其對(duì)病毒復(fù)制的影響。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S852.65
【部分圖文】：

) 5’接頭連接：5’接頭連接至產(chǎn)物的 5’端，由于接頭優(yōu)先連接于單鏈分子，而3’接頭和 RT 引物的雜交鏈連接，極大減少了接頭自連；) 一鏈 cDNA 合成：以 RT 引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄延伸，合成一鏈 cDNA；) PCR 擴(kuò)增：使用高敏聚合酶對(duì) cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，富集同時(shí)連接有 3’接頭和頭的 cDNA，放大文庫(kù)產(chǎn)量；) 文庫(kù)片段選擇：使用 PAGE 電泳分離 100-120 bp 范圍 PCR 產(chǎn)物，有效去除二聚體等副產(chǎn)物；) 文庫(kù)定量及 pooling 環(huán)化。數(shù)據(jù)處理序所得 49 nt 序列，通過(guò)去接頭、去低質(zhì)量、去污染等過(guò)程完成數(shù)據(jù)處理得用分析的目標(biāo)序列，對(duì)其進(jìn)行序列長(zhǎng)度分布的統(tǒng)計(jì)及樣品間公共序列統(tǒng)計(jì)。目標(biāo)序列分類(lèi)注釋?zhuān)@得樣品中包含的各組分及表達(dá)量信息。將所有小 RN后，用剩下的未注釋片段來(lái)進(jìn)行：1）novel miRNA 預(yù)測(cè)；2）已知 miRNA預(yù)測(cè)。對(duì)于鑒定得到的 miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)和對(duì)靶基因的 GO 功能注釋 pathway 注釋?zhuān)▓D 2-1）。

圖 2-2 對(duì)照組和 PPRV-infected 樣品的 sRNA 長(zhǎng)度分布Fig.2-2 Length distribution of small RNA(18-30 nt) in control and PPRV-infectedNA 差異表達(dá)分析在 SangermiR Base 21.0 數(shù)據(jù)庫(kù)中使用 BLASTN 將測(cè)序樣品的 miRN羊成熟 miRNA 及其前體比對(duì)，我們確定了本次 miRNA 測(cè)序結(jié)果數(shù)量以及它們第一位點(diǎn)的堿基偏好性。在對(duì)照組和 PPRV-infecte胞文庫(kù)中分別鑒定出了 622 種（包括 260 種已知 miRNA 和 362 種新（包括 186 種已知 miRNA 和 298 種新 miRNA）。以 P 值＜0.01 并且ange）∣＞1 作為篩選閾值，共鑒定出 316 種差異表達(dá) miRNA（包括 和 213 種新 miRNA），與對(duì)照組相比，PPRV-infected 樣品文庫(kù)中 147 種，169 種 miRNA 表達(dá)下調(diào)（圖 2-3）（附件 2）。

圖 2-3 對(duì)照組及 PPRV-infected 山羊 PBMCs 中差異表達(dá) miRNAig.2-3 Comparison of differentially-expressed miRNAs between the Mock controlPPRV-infected goat PBMCs 靶基因預(yù)測(cè)用兩種獨(dú)立的算法（miRanda 和 RNAhybrid）對(duì) PPRV 感染后每種行靶基因預(yù)測(cè)。對(duì)對(duì)照組和 PPRV-infected 兩個(gè)樣品差異表達(dá)的 1013 種新 miRNA 共預(yù)測(cè)到 12,065 種靶基因。兩組共表達(dá)的 316 種基于靶基因在病毒感染、抗病毒反應(yīng)、細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用鑒定 2-1）。與對(duì)照組相比，在這 15 種差異表達(dá) miRNA 中，PPRV-infeA （ chi-miR-323a-3p ， chi-miR-485-5p ， chi-miR-1291 ， chi-m-5p，chi-miR-182，chi-miR-155-3p，novel_mir85，novel_mir70）表iRNA（chi-miR-1, chi-miR-143-3p, chi-miR-30b-3p, novel_mir330, no此外，這些差異表達(dá) miRNA 靶向的大多數(shù)基因?qū)γ庖咛右莨δ芫?
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2875868