偽狂犬病(PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一種對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大的傳染病。2011年下半年,PRV變異株在我國免疫豬群中開始流行。本實(shí)驗(yàn)室率先分離到變異株,命名為He N1株。研究表明接種現(xiàn)有疫苗株不能使易感動(dòng)物獲得對(duì)變異株的完全保護(hù),血清中和試驗(yàn)顯示疫苗株Bartha-K61與HeN1株之間存在明顯的抗原差異。gC蛋白是PRV重要的中和性抗原,其變異可能會(huì)導(dǎo)致疫苗株免疫豬體后產(chǎn)生的中和抗體不能對(duì)PRV變異株進(jìn)行有效的中和。因此我們利用酵母表面展示技術(shù)獲取疫苗株Bartha-K61與變異株HeN1 gC蛋白的抗原區(qū),來探究毒株間的抗原性差異。為了解PRV變異株的流行及變異情況,2016~2017年間,對(duì)來自安徽、河北、山東等省份的大中型豬場(chǎng)送檢的疑似PRV病料進(jìn)行PCR檢測(cè),鑒定出16份PRV陽性病料,對(duì)其gC、gE基因進(jìn)行序列分析,兩者氨基酸序列與2012年以來的變異株的相應(yīng)氨基酸序列同源性分別為98.2%~100%與99.3~100%,與經(jīng)典株的相應(yīng)氨基酸序列同源性相對(duì)較低,分別為92.5%~94.8%與95.3%~99.1%。變異株的gE蛋白均在第48位和第492位各插入1個(gè)天冬氨酸,在gC蛋白的64~70位處連續(xù)插入7個(gè)氨基酸,分離株具有與變異株相同的分子標(biāo)記,并且分離的16株P(guān)RV與GenBank下載的近年來國內(nèi)報(bào)道的PRV變異毒株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上處于同一分支,與經(jīng)典株位于不同分支,表明HeN1株仍是目前PRV流行毒株的代表毒株。本研究利用DNase I將疫苗株Bartha-K61與變異株He N1的gC基因隨機(jī)酶切成100~250 bp的小片段,然后連接到酵母展示載體pCTCON2中,將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中構(gòu)建隨機(jī)的酵母展示文庫。提取兩個(gè)文庫的質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)入制備的釀酒酵母EBY-100感受態(tài)中進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)。用抗Bartha-K61與抗HeN1株的豬陽性血清分別對(duì)兩個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)后的酵母文庫進(jìn)行染色,通過流式細(xì)胞儀對(duì)陽性酵母進(jìn)行經(jīng)兩輪分選富集,提取富集后陽性酵母的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析,通過分析克隆的分布及個(gè)數(shù)來繪制抗原區(qū)圖譜。結(jié)果顯示,HeN1-gC蛋白的主要抗原區(qū)位于A1區(qū)(23-152位aa)、次要抗原區(qū)位于A3區(qū)(337-487位aa)、非抗原區(qū)位于A2區(qū)(153-336位aa);Bartha-K61-gC蛋白的主要抗原區(qū)位于B1區(qū)(23-130位aa)、次要抗原區(qū)位于B2區(qū)(131-222位aa)、非抗原區(qū)位于B3區(qū)(223-480位aa)。將兩毒株gC蛋白的各抗原區(qū)片段進(jìn)行酵母展示表達(dá)與原核表達(dá),進(jìn)行流式分析與ELISA分析,結(jié)果驗(yàn)證了兩毒株gC蛋白的各抗原區(qū)的抗原特性,抗原區(qū)與血清交叉分析表明兩毒株gC蛋白的主抗原區(qū)的抗原性差異不大,次要抗原區(qū)的抗原性存在差異,非抗原區(qū)與血清交叉分析存在一定的抗原性,本研究推測(cè)PRV兩毒株gC蛋白之間的抗原差異性可能與氨基酸的同源性關(guān)系較小,而與病毒自身的調(diào)控有關(guān)。綜上所述,本研究利用酵母展示技術(shù)將構(gòu)建的疫苗株Bartha-K61與變異株HeN1的gC蛋白抗原文庫展示于酵母表面,篩選并鑒定了兩毒株gC蛋白的主抗原區(qū)與次抗原區(qū),以上研究為揭示PRV毒株間的變異及免疫逃避的機(jī)制提供基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

學(xué)院碩士學(xué)位論文 第），G+C 含量高達(dá) 73%。病毒基因組包含 UL（110kb）和 US（10kb）兩個(gè)獨(dú)是內(nèi)部重復(fù)序列（IRS，15kb）和末端反向重復(fù)序列（TRS，15kb） (Ben-Porat el., 2016)。PRV 的基因組包含 73 個(gè)開放閱讀框，編碼 70 多種病毒蛋白，包含、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和復(fù)制酶等 (劉博濤等，2008)，其中胸苷激酶（TK）、核苷等幾種酶是 PRV 重要的毒力基因。

論文 分選抗原的原理兩端融合血凝素 HA 標(biāo)簽和 C-myc 標(biāo)簽，用于檢測(cè)目的蛋抗和抗 C-myc 的抗體檢測(cè)酵母表面蛋白的展示情況。我出來，來研究基因型與表型的聯(lián)系。首先將酵母文庫與特異體。由于相同種屬 IgG 抗體的 FC 配體相同，若選擇相對(duì)過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選（圖 1.3）；若二抗用其他偶聯(lián)物標(biāo)的蛋白 (Cochran et al., 2010)。流式細(xì)胞儀篩選出的目的蛋母的速度較快，流式細(xì)胞儀還可測(cè)定酵母展示蛋白的化學(xué)al.; 2012)。

圖 2.1 PRV 變異株 gE 氨基酸序列插入 2 個(gè)天冬氨酸Fig 2.1 Insertion of two aspartic acids in gE gene encoding amino acid for PRV variants
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2875441