CHIR99021(簡(jiǎn)稱CHIR)能有效激活J1和F9細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路,并能促進(jìn)多能性基因Nanog表達(dá)。miR-211是Wnt/β-catenin信號(hào)通路應(yīng)答的miRNA,CHIR通過(guò)激活Wnt/β-catenin誘導(dǎo)miR-211表達(dá)。mi R-211在調(diào)節(jié)細(xì)胞多能性方面的報(bào)道還比較少,所以本項(xiàng)目主要研究miR-211對(duì)F9細(xì)胞中多能性因子的調(diào)節(jié)作用。首先根據(jù)文獻(xiàn),用10μmol的CHIR處理小鼠F9細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中miR-211表達(dá)水平顯著上調(diào)。接下來(lái)在F9細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-211 mimic及其NC,miR-211 inhibitor及其NC,qPCR及western檢測(cè)幾個(gè)多能性因子的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mimic后,Nanog、Klf4及Oct4在mRNA水平變化均不顯著,而在蛋白水平表達(dá)量都呈上升趨勢(shì);轉(zhuǎn)染inhibitor后,它們?cè)趍RNA水平變化也不顯著,但在蛋白水平表達(dá)量都呈下降趨勢(shì)。免疫熒光顯示,轉(zhuǎn)染mimic后,與對(duì)照組相比,Nanog、Klf4及Oct4的熒光亮度都增強(qiáng)。預(yù)示著miR-211對(duì)F9細(xì)胞多能性的維持具有一定作用。為進(jìn)一步探究miR-211如何發(fā)揮功能,首先從它的靶基因入手。通過(guò)軟件預(yù)測(cè)miR-211的靶基因并取交集,聚類分析后,選出在與細(xì)胞多能性相關(guān)通路上的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。在F9細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-211 mimic,qPCR初步檢測(cè)所選的四個(gè)靶基因,結(jié)果顯示Meis1的mRNA水平下調(diào)最顯著。為驗(yàn)證Meis1是否為miR-211靶基因,首先根據(jù)預(yù)測(cè)的miR-211與Meis1結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建Meis1野生型及突變型報(bào)告載體。雙熒光素酶報(bào)告分析顯示,Meis1會(huì)受到miR-211的抑制,而突變掉兩者結(jié)合位點(diǎn)后,其抑制作用會(huì)解除,說(shuō)明兩者的結(jié)合位點(diǎn)是突變位點(diǎn)。qPCR及western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mimic后,Meis1的表達(dá)量在mRNA及蛋白水平都顯著下調(diào)。而轉(zhuǎn)染inhibitor后,Meis1的表達(dá)量在m RNA及蛋白水平都有上調(diào)趨勢(shì)。由此可以確定Meis1為mi R-211的靶基因。對(duì)靶基因Meis1功能的研究,首先構(gòu)建了Meis1的表達(dá)載體。用CHIR處理F9細(xì)胞,當(dāng)濃度為10μmol時(shí)Meis1在mRNA水平顯著下調(diào),顯示CHIR可能是通過(guò)促進(jìn)miR-211表達(dá)從而抑制Meis1表達(dá)。接下來(lái)用qPCR及western的方法檢測(cè)Meis1對(duì)F9細(xì)胞中多能性因子的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)Meis1后,Nanog在mRNA及蛋白水平都呈下調(diào)趨勢(shì),Klf4和Oct4在m RNA水平下調(diào)趨勢(shì)不顯著,兩者在蛋白水平都顯著下調(diào)。干擾Meis1后,Nanog和Oct4在mRNA和蛋白水平都呈上調(diào)趨勢(shì)。Klf4在m RNA水平上調(diào)趨勢(shì)不顯著,在蛋白水平顯著上調(diào)。由此顯示miR-211對(duì)F9細(xì)胞中Nanog、Klf4及Oct4的調(diào)節(jié)作用可能是通過(guò)靶向Meis1來(lái)完成的。本項(xiàng)目主要探究了CHIR處理F9細(xì)胞后,促進(jìn)細(xì)胞中miR-211的表達(dá),miR-211通過(guò)靶向Meis1來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞中Nanog、Klf4及Oct4的表達(dá)。由此說(shuō)明miR-211對(duì)F9細(xì)胞多能性的維持具有一定的作用。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S813.1
【部分圖文】：

Start Green qPCR Supermix 試 5-10 倍，每個(gè)樣品重復(fù)三 qPCR10μL0.4μL0.4μL0.4μL2μLUP to 20μL5℃ 5s；60℃ 30s；step2-st定量分析。IR處理F9細(xì)胞后，miR-211p 呈明顯上升趨勢(shì)（如圖 2-1

圖 3-1 過(guò)表達(dá) miR-211 后 Nanog、Klf4 及 Oct4 的 mRNA 表達(dá)變化Fig.3-1 Expression changes of Nanog, Klf4 and Oct4 at the mRNAlevel after overexpression of miR-211圖 3-2 過(guò)表達(dá)及抑制 miR-211 后 Nanog、Klf4 及 Oct4 的蛋白表達(dá)變化Fig.3-2 Expressive changes of Nanog, Klf4 and Oct4 at the protein level after overexpression and inhibitionof miR-211

過(guò)表達(dá) miR-211 后 Nanog、Klf4 及 Oct4 的 mRNA 表ges of Nanog, Klf4 and Oct4 at the mRNAlevel after o
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉琳;葉啟東;湯靜燕;;MEIS1在MLL相關(guān)白血病中作用的研究進(jìn)展[J];國(guó)際兒科學(xué)雜志;2009年06期

本文編號(hào)：2872251