馬立克氏病(Marek’s Disease,MD)是易感禽類中高度傳染的病毒性腫瘤疾病,是家禽養(yǎng)殖業(yè)潛在的威脅,常引起大規(guī)模的發(fā)病,造成重大的經(jīng)濟損失。雖然有疫苗的防疫,但其的作用具有局限性,MD的防控仍然面臨著更多的挑戰(zhàn)。在雞感染馬立克病毒(Marek’s disease virus,MDV)后,選擇前期研究結(jié)果中被富集到Pi3k-Akt信號通路中,且與腫瘤發(fā)生相關(guān)的差異表達基因,結(jié)合MDV感染病程的特點,擬應用復方中藥制劑和MD模型雞,研究MDV感染對雞Pi3k-Akt信號通路中8個腫瘤相關(guān)因子Itga2b、Itgb1、Fak、Pik3ca、Pdpk1、Akt1、Mdm2、p53及tert表達的影響,以及復方中藥制劑對其干預的作用效果,旨在為防治MDV感染關(guān)鍵靶基因的篩選、中藥復方制劑作為飼料添加劑預防MD奠定基礎,對家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有一定的實踐意義。應用qPCR及Western Blot對腫瘤相關(guān)因子表達水平,以及改進的TRAP銀染法對端粒酶活性進行試驗,結(jié)果表明:1.對MDV感染雞脾臟Pi3k-Akt信號通路中8個腫瘤相關(guān)因子及端粒酶活性的分析結(jié)果顯示:(1)與對照組相比,雞感染MDV后,其脾臟組織Pi3k-Akt信號通路中腫瘤相關(guān)因子Itgb1、Mdm2、p53在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均升高,且差異極顯著(P0.01);(2)因子Itga2b、Fak轉(zhuǎn)錄水平升高,差異顯著(P0.05),其蛋白水平呈升高趨勢,但差異不顯著(P≥0.05);(3)因子Pik3ca、Akt1轉(zhuǎn)錄水平升高,差異極顯著(P0.01),其蛋白水平升高,差異顯著(P0.05);(4)因子Pdpk1在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平差異均呈升高趨勢,但差異不顯著(P≥0.05);(5)因子Akt1(Ser473)蛋白水平升高,差異顯著(P0.05);(6)基因tert轉(zhuǎn)錄水平降低,差異顯著(P0.05)。(7)與對照組比較,在MDV感染雞后,其脾臟組織端粒酶活性升高,差異極顯著(P0.01)。2.復方中藥制劑作用于MD模型雞后,其脾臟組織Pi3k-Akt信號通路中8個腫瘤相關(guān)因子及端粒酶活性的分析結(jié)果顯示:(1)因子Itga2b在轉(zhuǎn)錄水平升高,差異極顯著(P0.01),蛋白水平無顯著性差異(P≥0.05);(2)因子Itgb1、Fak、Pdpk1轉(zhuǎn)錄水平降低,差異極顯著(P0.05),其蛋白水平呈降低趨勢,差異不顯著(P≥0.05);(3)因子Pik3ca、Akt1轉(zhuǎn)錄水平降低,差異極顯著(P0.01),其蛋白水平降低,差異顯著(P0.05);(4)因子Mdm2、p53轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均降低,差異極顯著(P0.01);(5)因子Akt1(Ser473)蛋白水平降低,差異顯著(P0.05);(6)基因tert轉(zhuǎn)錄水平升高,差異不顯著(P≥0.05);(7)與對照組比較,端粒酶活性無顯著性差異(P≥0.05)。綜上所述,在雞感染MDV后,脾臟組織Pi3k-Akt信號通路腫瘤中相關(guān)因子、端粒酶活性均發(fā)生一定程度的上調(diào);添加復方中藥制劑飼喂MDV感染的雞后,對雞脾臟中Pi3k-Akt信號通路中腫瘤相關(guān)因子有一定的下調(diào)作用。本研究結(jié)果將為以該通路相關(guān)基因作為靶點篩選中藥復方制劑,有效防止MD提供參考依據(jù)。
【學位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S858.31
【部分圖文】：

先將凝膠置于固定液中固定 10 min；再用凝膠中進行銀染 10 min；最后用顯影液顯色至所需條帶出現(xiàn)應中間均需要用去離子水洗 2 次。銀染后，掃描凝膠，析成像系統(tǒng)掃描，使用 Image J、SPSS（PASW Statistics）18帶灰度值進行統(tǒng)計學分析，計算相對端粒酶活力，結(jié)果端粒酶活力＝總條帶強度/0.02 amol R5 擴增產(chǎn)物條帶強總 RNA 提取結(jié)果與分析提取的總 RNA，經(jīng)超微量核酸蛋白分析儀分析顯示，各5 至 2 之間，表明提取的總 RNA 純度良好。提取各樣本 18S 和 5S，3 條帶清晰可辯，完整性良好（如圖 2）。

3 Pi3k-Akt 信號通路中腫瘤相關(guān)因子 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 products agarose gel electrophoresis results of tumor-associated factors in thsignaling pathway基因條帶；2：itgb1 目的基因條帶；3：fak 目的基因條帶；4：pdpk1 目的基因條帶；5：akt1 目的基p53 目的基因條帶；8：β-actin 目的基因條帶；9：pik3ca 目的基因條帶；10：tert 目的基因條帶；1rget gene; 2: itgb1 target gene; 3: fak target gene; 4: pdpk1 target gene; 5: akt1 target gene; 6: mdm2 target gene; 8: β-actin target gene; 9: pik3ca target gene; 10: tert target gene; 11: negative control Pi3k-Akt 信號通路中腫瘤相關(guān)因子及 tert 轉(zhuǎn)錄水平的影響織樣品 cDNA 經(jīng) qPCR 擴增，分別得到各基因標準曲線、擴增擴增效率良好，且各基因 qPCR 產(chǎn)物只有一個特異峰，無引物標準曲線 R2值在 0.994 至 0.999 之間（詳見附錄一）。得到各制圖表如圖 4 和表 3，由圖 4、表 3 可知在 MDV 感染雞后，其通路中腫瘤相關(guān)因子 itgb1、fak、pik3ca、akt1、mdm2、p53 轉(zhuǎn)著（P＜0.01）；因子 itga2b 轉(zhuǎn)錄水平升高，差異顯著（P＜0.

DV 對雞 Pi3k-Akt 信號通路腫瘤中相關(guān)因子及 tert 轉(zhuǎn)錄水平影響的結(jié)果ffect of MDV on transcription levels of associated factors in tumor of Pi3k-Apathway in chicken (n=3)顯著（P＜0.05），“**”表示差異極顯著（P＜0.01），無“*”表示差異不顯著（P≥0.05），以下各tes significant difference (P＜0.05), “**” indicates extremely significant difference (P＜0.01), and “*” indidifference (P≥0.05)，the following charts are labeled the same.DV 對雞 Pi3k-Akt 信號通路腫瘤中相關(guān)因子及 tert 轉(zhuǎn)錄水平影響的結(jié)果ffect of MDV on transcription levels of associated factors in tumor of Pi3k-Apathway in chicken (n=3)基因名稱Gene Name組別Group對照組Control group試驗組Experimental groupitga2b 1 1.32±0.09*
【參考文獻】

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本文編號：2871887