發(fā)布時(shí)間：2020-11-02 06:42

　　 塞內(nèi)卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)屬于小RNA病毒科塞內(nèi)卡病毒屬成員,與心肌炎病毒屬成員的遺傳關(guān)系最近。近年發(fā)現(xiàn)SVV與豬特發(fā)性水皰病(Porcine idiopathic vesicular disease,PIVD)和流行性新生兒暫時(shí)性死亡(Epidemic transient neonatal losses,ETNL)等新病原相關(guān),感染豬臨床表現(xiàn)為跛行,水皰并伴有精神沉郁、厭食,新生仔豬病死率高達(dá)30%~70%。自2014年以來(lái),在全球多個(gè)國(guó)家報(bào)道了SVV感染所致PIVD的病例。我國(guó)廣州一家豬場(chǎng)首次報(bào)道SVV感染,隨后在湖北、黑龍江、河南、福建和廣東等地陸續(xù)出現(xiàn)SVV感染病例。作為豬新發(fā)的傳染病病原,目前對(duì)其與宿主的抗病毒相互作用關(guān)系知之甚少。SVV是如何導(dǎo)致豬體發(fā)病,急需從各個(gè)層面進(jìn)行解析其致病機(jī)理。鑒于此,本研究從病毒的分離鑒定、SVV感染性克隆的構(gòu)建以及SVV對(duì)宿主抗病毒天然免疫的調(diào)控三方面進(jìn)行了研究。具體內(nèi)容如下:1.SVV的分離與鑒定從臨床疑似SVV感染的特發(fā)性水皰病仔豬中采集水皰液,對(duì)可造成豬只水皰性疾病的重要病原,如水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV),口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)和豬水皰病病毒(Swine vesicular disease virus,SVDV)進(jìn)行病原特異性PCR檢測(cè),結(jié)果擴(kuò)增出特異性目的帶,測(cè)序結(jié)果表明與SVV高度同源,表明該臨床病例由SVV感染導(dǎo)致。隨后,利用BHK-21細(xì)胞對(duì)SVV進(jìn)行病毒分離,獲得了可引起B(yǎng)HK-21細(xì)胞發(fā)生典型細(xì)胞病變,在感染BHK-21細(xì)胞48小時(shí)后可產(chǎn)生直徑為1~3毫米的病毒噬斑,利用SVV VP1蛋白多克隆抗體對(duì)病毒樣品進(jìn)行免疫熒光和蛋白印記檢測(cè),結(jié)果均顯示為VP1反應(yīng)陽(yáng)性。在電子顯微鏡下可以觀察到直徑為26-30 nm無(wú)囊膜的病毒粒子。綜合這些結(jié)果表明我們分離到的病毒為SVV,并命名為SVV HB-CH-2016。在獲得SVV HB-CH-2016后,我們?cè)O(shè)計(jì)多條特異性的引物進(jìn)行其全基因組擴(kuò)增,將擴(kuò)增的片段亞克隆入p Easy-Blunt載體中進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明,SVV HB-CH-2016全長(zhǎng)基因組為7300 bp,包括668 bp的5￠非編碼區(qū),一個(gè)編碼2181個(gè)前體多聚蛋白的開放閱讀區(qū)以及86 bp具有poly A特性的3￠非編碼區(qū)。全基因組已提交于Gene Bank,登錄號(hào)為KX377924。2.CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的SVV感染性克隆的建立本研究中以p Bluescript SKⅡ?yàn)檩d體,建立了由CMV啟動(dòng)子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的SVV HB-CH-2016株的感染性克隆質(zhì)粒,命名為p SKⅡ-CMV-SVV/HB。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p SKⅡ-CMV-SVV/HB于293T或BHK-21細(xì)胞,36小時(shí)后可觀察到類似SVV感染的細(xì)胞病變效應(yīng)。免疫熒光檢測(cè)、蛋白印記和特異性PCR進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,成功地拯救出SVV(r SVV)。病毒噬斑檢測(cè)結(jié)果表明r SVV和野生型SVV在BHK-21細(xì)胞上產(chǎn)生的噬斑大小無(wú)差異。上述結(jié)果表明成功建立了CMV驅(qū)動(dòng)的SVV感染性克隆平臺(tái),為SVV相關(guān)病毒特性、病毒載體和新型病毒疫苗等研究奠定了基礎(chǔ)。3.SVV感染負(fù)調(diào)控Ⅰ干擾素的產(chǎn)生本研究首先利用雙熒光素酶活性報(bào)告系統(tǒng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR探究了SVV感染對(duì)干擾素產(chǎn)生的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SVV感染不能激活干擾素IFN-b啟動(dòng)子活性和IFN-bm RNA的產(chǎn)生。通過(guò)對(duì)IRF3活性的檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)SVV不能有效的誘發(fā)IRF3發(fā)生磷酸化以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)。此外,IFN-b處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),IFN-b可顯著抑制SVV的增殖。以上結(jié)果表明,SVV是一個(gè)干擾素敏感的病毒,但是SVV感染不觸發(fā)宿主干擾素產(chǎn)生應(yīng)答。這暗示,SVV可能通過(guò)某種機(jī)制逃避宿主的抗病毒免疫應(yīng)答。4.SVV 3Cpro負(fù)調(diào)控宿主Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生構(gòu)建SVV蛋白的表達(dá)質(zhì)粒,利用雙熒光素酶活性報(bào)告系統(tǒng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR探究了SVV感染對(duì)干擾素產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示SVV VP2,3Cpro和3D均不同程度抑制了Sev對(duì)IFN-b啟動(dòng)子的激活,3Cpro抑制效應(yīng)極顯著(P0.001)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)、IRF3核轉(zhuǎn)運(yùn)、磷酸化IRF3蛋白水平等證實(shí)SVV 3Cpro對(duì)IFN-b產(chǎn)生的負(fù)調(diào)控作用。以上結(jié)果證實(shí),SVV 3Cpro能有效拮抗宿主Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。5.SVV 3Cpro靶向拮抗Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制通過(guò)雙熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)IFN-β的啟動(dòng)子活性,發(fā)現(xiàn)SVV 3Cpro效應(yīng)區(qū)間位于RIG-1/MDA-5通路與IRF3上游之間。將天然免疫信號(hào)通路相關(guān)接頭分子分別與SVV HA-3C共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,Western blot結(jié)果表明,SVV 3Cpro特異性切割MAVS,TRIF和TANK。蛋白降解途徑相關(guān)抑制劑MG132、NH4Cl和Z-VAD-FMK均不能抑制SVV 3Cpro對(duì)MAVS、TRIF和TANK的切割效應(yīng)。酶活性缺失突變體結(jié)果顯示SVV 3Cpro對(duì)MAVS、TRIF和TANK切割效應(yīng)依賴其蛋白酶活性。免疫共沉淀(Co-IP)和細(xì)胞內(nèi)激光共聚焦觀察定位分析結(jié)果顯示SVV 3Cpro與MAVS,TRIF和TANK存在相互作用。依據(jù)SVV 3Cpro裂解病毒多聚前體蛋白的識(shí)別位點(diǎn),構(gòu)建了MAVS、TRIF和TANK的一系列潛在切割位點(diǎn)突變體,Western blot檢測(cè)對(duì)各個(gè)蛋白的切割情況。結(jié)果顯示SVV 3Cpro分別在Q148和Q159氨基酸殘基切割MAVS和TRIF,而在E272和Q291對(duì)TANK進(jìn)行了兩次切割。上述結(jié)果表明,MAVS、TRIF和TANK的切割位點(diǎn)突變體可抵御SVV 3Cpro的切割效應(yīng),保持其對(duì)IFN-b的激活作用;而MAVS和TANK的任何切割產(chǎn)物都失去了對(duì)IFN-b的激活作用;TRIF切割后其N端產(chǎn)物失去激活I(lǐng)FN-b產(chǎn)生的作用,但其C端產(chǎn)物仍然具有活性。此外,SVV感染后可上調(diào)NF-kB信號(hào)通路依賴的炎性細(xì)胞因子IL-6和TNFam RNA的轉(zhuǎn)錄。SVV 3Cpro的表達(dá)可增強(qiáng)Sev感染對(duì)NF-kB信號(hào)通路的激活作用。SVV 3Cpro介導(dǎo)的TANK切割可促進(jìn)TRAF6誘導(dǎo)的NF-kB信號(hào)通路的激活。綜上所述,本研究從臨床疑似PIDV病例中分離一株SVV;建立了SVV的感染性克隆;證實(shí)SVV 3Cpro通過(guò)特異性切割宿主抗病毒天然免疫相關(guān)重要接頭分子MAVS、TRIF和TANK,負(fù)調(diào)控Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,從而逃避宿主的抗病毒免疫。3Cpro對(duì)TANK的切割也促進(jìn)了TRAF6介導(dǎo)的NF-kB信號(hào)通路的激活,這與SVV感染激活宿主NF-kB信號(hào)通路,誘發(fā)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生存在重要相關(guān)性。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

圖 1-1 小 RNA 病毒分類Fig. 1-1 Classification of small RNA virus(ICTV, 2018)病毒顆粒呈球形，二十面體衣殼圍繞裸 RNA 基因組。殼體由 60 個(gè)原子密二十面體排列組成，每個(gè)由長(zhǎng)度分別為 265、286、241 和 74 個(gè)殘基的四個(gè) VP1，VP2，VP3 和 VP4 組成，VP4 位于衣殼的內(nèi)側(cè)。SVV 具有疏水口袋口袋因子(Venkataraman et al 2008b)。病毒顆粒直徑約 26-30nm。病毒粒子件下更具穩(wěn)定性，pH 值≤5.5 時(shí)分解為五聚體亞基(Strauss et al 2017)。

圖 1-1 小 RNA 病毒分類Fig. 1-1 Classification of small RNA virus(ICTV, 2018)顆粒呈球形，二十面體衣殼圍繞裸 RNA 基因組。殼體由 60面體排列組成，每個(gè)由長(zhǎng)度分別為 265、286、241 和 74 個(gè)殘，VP2，VP3 和 VP4 組成，VP4 位于衣殼的內(nèi)側(cè)。SVV 具有因子(Venkataraman et al 2008b)。病毒顆粒直徑約 26-30nm。更具穩(wěn)定性，pH 值≤5.5 時(shí)分解為五聚體亞基(Strauss et al 2

圖 1-3 SVV 基因組模式圖Fig.1-3 Schematic diagram of the SVV genome(ViralZone, 2010)1.1.1.2.1 5’UTR 和 3’UTRSVV 5’UTR 的一部分堿基（nt406-625）與丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）具有 57.3%的核苷酸序列同一性，表明 SVV 可能含有一個(gè) IV 型內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（Internal ribozyme entry site, IRES），其功能是允許通過(guò)抑制細(xì)胞 RNA 的翻譯來(lái)獨(dú)立翻譯病毒 RNA。隨后，研究學(xué)者對(duì)包括各種黃病毒、小核糖核酸病毒和 SVV的二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析預(yù)測(cè)，支持了 SVV IRES 是 IV 型的假說(shuō)(Flather and SemLer 2015;Martinez-Salas et al 2015)。SVV IRES 與 HCV 和豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）的 IRES 關(guān)系密切可能是基因組之間發(fā)生獨(dú)立的重組(Willcocks et al 2011)。通過(guò)對(duì) SVV 5’UTR 的 1-400 nt 的分析預(yù)測(cè)，顯示其有一個(gè)高水平的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括7 個(gè)簡(jiǎn)單的和 2 個(gè)復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(Hales et al 2008)。SVV 基因組 RNA 在其 5'端共價(jià)連接一個(gè)病毒蛋白 VPg（virio protein），而不是甲基化的核苷酸帽結(jié)構(gòu)，這對(duì)起始病毒 RNA 合成起著重要的作用。
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