發(fā)布時間：2020-11-01 09:06

　　 布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌引起的一種嚴(yán)重的人畜共患傳染病,在世界各地均有發(fā)生,發(fā)展中國家尤為嚴(yán)重。布魯氏菌是典型的胞內(nèi)寄生菌,其侵襲能力強(qiáng),感染的宿主及途徑廣,現(xiàn)已知能夠感染布魯氏菌的動物多達(dá)60余種,豬、牛、羊均為易感動物,且各家畜之間存在交叉感染。近年來隨著牛、羊布魯氏菌疫情的回升,吉林省梅花鹿布魯氏菌病時有發(fā)生,患病圈養(yǎng)的鹿已成為人類感染布魯氏菌病的重要傳染源之一,影響國民經(jīng)濟(jì),同時給人類健康及畜牧業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重影響。預(yù)防和控制布魯氏菌病的首要措施是減毒疫苗免疫,但疫苗免疫后持續(xù)產(chǎn)生抗體,常規(guī)的血清學(xué)檢測方法不能區(qū)分自然感染和人工免疫動物,不利于布魯氏菌病的防控與凈化。BCSP31基因作為布魯氏菌的保護(hù)性抗原,具有良好的免疫原性,有研究表明該基因的缺失不影響布魯氏菌的生存,可以作為缺失株疫苗的靶基因。因此,本研究在對吉林省梅花鹿布魯氏菌流行情況及相關(guān)風(fēng)險分析的基礎(chǔ)上,選定S2疫苗株為親本株,構(gòu)建布魯氏菌S2-BCSP31缺失株,以布魯氏菌S2-BCSP31缺失株感染巨噬細(xì)胞,分析BCSP31基因在布魯氏菌逃避宿主免疫機(jī)制中的作用機(jī)制,并對構(gòu)建的缺失株安全性及保護(hù)性進(jìn)行評估;以BCSP31蛋白為包被抗原建立ELISA檢測方法,對布魯氏菌S2-BCSP31缺失株作為候選疫苗株的可行性分析;以期對布魯氏菌病的防控與致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、通過虎紅平板凝集試驗(yàn)和熒光定量PCR方法對采集的458份梅花鹿血液樣本進(jìn)行血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測,虎紅平板凝集檢測57份陽性血清,4份疑似血清;熒光定量PCR共檢測59份陽性樣本,總陽性率為12.9%(59/458);其中豬種布魯氏菌27份、羊種布魯氏菌19份、牛種布魯氏菌13份,分析季節(jié)為梅花鹿感染布魯氏菌的風(fēng)險因素。2、以S2為親本株,利用同源重組技術(shù)構(gòu)建布魯氏菌S2-BCSP31缺失株,生物學(xué)特性鑒定證明S2-BCSP31缺失株在形態(tài)學(xué)、生長特性、生化特性等方法與親本株保持一致;連續(xù)傳20代及保存12個月后的S2-BCSP31缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性;Western Blot鑒定表明缺失株不與rBCSP31蛋白高免血清發(fā)生反應(yīng),BCSP31蛋白在缺失株中不表達(dá),說明S2-BCSP31缺失株構(gòu)建成功。3、建立S2-BCSP31缺失株和S2疫苗株巨噬細(xì)胞體外感染模型,分析BCSP31缺失對巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子及自噬互相作用的影響,結(jié)果表明S2-BCSP31缺失株上調(diào)IL-12、IL-β的表達(dá),下調(diào)IL-6、TNF-α炎癥因子的表達(dá),有利于LC3B、Beclin、p62、Bcl2蛋白表達(dá)。對布魯氏菌誘導(dǎo)的PI3K/Akt/mTOR和MER/ERK信號通路蛋白表達(dá)分析,證實(shí)S2-BCSP31缺失株有利于PI3K/Akt/mTOR自噬途徑激活。抑制該通路后自噬相關(guān)基因LC3B、Beclin及ULK的mRNA表達(dá)水平和胞內(nèi)菌落數(shù)下降,證明該通路激活有利于S2-BCSP31缺失株在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活。4、免疫小鼠后,毒力殘留實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示S2-BCSP31缺失株與S2親本株免疫的小鼠脾臟重量及含菌量基本吻合,證明構(gòu)建的缺失株與親本株生物安全性無差別;抗體檢測和細(xì)胞因子檢測結(jié)果表明S2-BCSP31缺失株與S2親本株誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫之間差異不顯著。攻毒后結(jié)果顯示:S2-BCSP31缺失株能夠抵抗M28、2308、1330強(qiáng)毒攻擊,小鼠的脾臟重量及含菌量S2-BCSP31缺失株組和S2疫苗株組之間差異不顯著,但與陰性對照組差異極顯著(p0.01),證明S2-BCSP31缺失株與S2疫苗株在短期內(nèi)產(chǎn)生的免疫保護(hù)力一致,布魯氏菌S2-BCSP31缺失株具有良好的潛力。5、以rBCSP31蛋白為抗原建立ELISA檢測方法,結(jié)果表明M28、1330、2308攻毒及S2疫苗株免疫小鼠血清呈陽性,S2-BCSP31缺失株免疫小鼠血清呈陰性,證明該方法能夠區(qū)分S2-BCSP31缺失株免疫及其他自然感染的血清,為建立與標(biāo)記疫苗配套的檢測方法奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。綜上所述,本研究構(gòu)建的布魯氏菌S2-BCSP31缺失株具有良好安全性及保護(hù)性,具備從血清學(xué)角度區(qū)分布魯氏菌S2-BCSP31及野毒感染的能力,作為疫苗有良好的應(yīng)用前景,對布魯氏菌病防制、監(jiān)測、凈化及致病機(jī)制研究具有重要的意義。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

胞內(nèi)擴(kuò)散均具有重要的意義。1.3.2 布魯氏菌與自噬1.3.2.1 細(xì)胞自噬自噬是 1962 年由 Ashford 和 Porten 首次提出的，對于細(xì)胞中存在的自食象被稱為自噬。其是指源于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)的雙層膜結(jié)構(gòu)，包裹老化的細(xì)胞器、錯誤折疊的蛋白質(zhì)以及部分胞質(zhì)形成自噬體（autophagiosome其能夠與溶酶體融合，形成自噬溶酶體并對內(nèi)含物進(jìn)行降解，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身代謝需要以及某些細(xì)胞成分的更新，在細(xì)胞生長、發(fā)育以及一些疾病中發(fā)揮重作用。自噬的發(fā)生經(jīng)過四個階段（圖 1）：自噬膜的形成、自噬體的形成、自噬的運(yùn)輸融合及自噬體的降解。具體過程為：細(xì)胞接收到自噬誘導(dǎo)的信號后會在漿處形成一個自噬膜結(jié)構(gòu)；然后將需要降解的部分包裹在膜內(nèi)形成一個密封的狀自噬體；自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最后依靠溶酶體的酸性降解降解包裹得到物質(zhì)。此過程對細(xì)胞自身的組成成分的分解及再利用、清除入侵病原菌、維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有重要作用。

自噬信號通路Fig.2Autophagysignaling

圖 1-1 IS711 通用引物熒光定量 PCR 檢測結(jié)果Fig.1-1 Results of Fluorescence quantitative PCR by IS711primer1.3.3 BMEII0466 引物熒光定量 PCR 檢測結(jié)果利用羊種引物（BMEII0466）及探針對通用型引物（IS711）檢測出的陽性基因組樣本進(jìn)行進(jìn)一步分型鑒定，結(jié)果顯示通用型引物（IS711）檢測出的 59 份布魯氏菌陽性樣本中羊種布魯氏菌占有 19 份。檢測結(jié)果如圖 1-2 所示：圖 1-2 BMEII0466 引物熒光定量 PCR 檢測結(jié)果Fig.1-2 Results of Fluorescence quantitative PCR by BMEII0466 primer1.3.4 BruAb-0168 引物熒光定量 PCR 檢測結(jié)果
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2865319