環(huán)二核苷酸中的c-di-GMP與c-di-AMP是廣泛存在細菌中的第二信使。而真核細胞中,特有的cGAS酶在dsDNA存在條件下,利用ATP和GTP合成雜交的2,,3'cGAMP,其作為第二信使的發(fā)現(xiàn)填補了從DNA傳感器到STING信號轉(zhuǎn)導的空白。高等生物天然免疫系統(tǒng)中,細胞內(nèi)STING蛋白是雙鏈DNA引起免疫應(yīng)答的重要接頭分子。cGAS-STING通路在胞質(zhì)雙鏈DNA(dsDNA)檢測中起著重要作用。當CDNs進入細胞內(nèi),通過STING-TBK1-IRF3信號通路產(chǎn)生I型干擾素,提高機體的天然免疫力。研究表明,dsDNA活化的cGAS會產(chǎn)生第二信使2',3'cGAMP,與c-di-GMP、c-di-AMP、3',3'cGAMP等細菌環(huán)二核苷酸(CDNs)相比,其與STING結(jié)合親和力更強。二聚體STINGCBD優(yōu)先結(jié)合不對稱的2',3'cGAMP而非對稱的3',3'CDNs,但STING分子采用對稱的二聚體構(gòu)象有效地結(jié)合其不對稱配體仍是一個有待解決的問題。本研究通過改造的核苷酸環(huán)化酶DncV(VC0179),實現(xiàn)VC0179-△LOOP的可溶性表達。改造后的VC0179,顯著提高GTP和ATP的利用率,減少酶的損耗,制備純化了 c-di-GMP、c-di-AMP和3',3'cGAMP三種小分子。表達構(gòu)建鼠源mcGAS有效片段,作為酶催化合成2',3'cGAMP小分子,成功制備了高純度的2',3'cGAMP小分子。生化實驗顯示2',3'cGAMP是與豬STING具有最高結(jié)合親和力的內(nèi)源性配體,這與內(nèi)源性配體與機體本身的親和力是最強的呈一致性。2',3'cGAMP激活豬源免疫細胞產(chǎn)生IRF3、IFN-β的效果顯著。本研究借助X-射線晶體學的方法解析了豬源STING蛋白的C端結(jié)構(gòu)域(CTD)上的STING CDN-binding domain(CBD)分別與第二信使 c-di-GMP、c-di-AMP、3',3'cGAMP 和 3',3'cGAMP 形成復合物(1.76-2.6 A)的三維空間結(jié)構(gòu),結(jié)果表明2',3'cGAMP與豬STING的親和力遠高于其他c-di-GMP、c-di-AMP和3',3'cGAMP五個小分子。對豬STINGCBD-CDNS復合物的結(jié)構(gòu)研究表明,豬STINGCBD可以形成不對稱的配體結(jié)合口袋來容納CDNs。非對稱的2',3'cGAMP和配體結(jié)合口袋之間的廣泛的相互作用和形狀互補使其成為豬STING最易結(jié)合的配體,而幾何約束限制了對稱的3',3'CDNs和豬STING之間的結(jié)合�？傊�,明確了豬STING采用不對稱構(gòu)象識別不對稱的小分子,確定配體結(jié)合和識別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),為解析豬STINGCBD-CDNs復合物的結(jié)構(gòu)研究提供了一個新的視角,這對激活和調(diào)節(jié)cGAS-cGAMP-STING途徑具有重要意義,進一步確認了 cGAS-STING通路的激活機制及其在抗病毒防御中的作用。致病性結(jié)核分枝桿菌編碼兩種DtxR家族金屬調(diào)節(jié)劑,IdeR和MntR。IdeR抑制鐵對基因表達的響應(yīng),MntR(Rv2788)作為一種錳依賴的轉(zhuǎn)錄抑制因子,抑制錳轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達,維持錳的穩(wěn)態(tài)。雖然對IdeR的結(jié)構(gòu)研究比較深入,但目前還沒有MntR結(jié)構(gòu)。在此,我們報告了結(jié)核分枝桿菌MntR結(jié)構(gòu)的apo和錳結(jié)合的兩個晶體結(jié)構(gòu)。MntR已經(jīng)演變成和其他DtxR蛋白質(zhì)一樣的有兩個金屬離子結(jié)合位點。我們首次捕獲了兩個完全被其天然離子占據(jù)的位點。第一個位點有一個Mn2+離子,第二個結(jié)合位點有兩個Mn2+(雙核錳群集)。錳結(jié)合所引起的MntR構(gòu)象的改變可以使MntR與DNA結(jié)合,這是DtxR家族中保守的活化機制。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

?山東大學博士學位論文器分子（ＭＡＶＳ）相互作用。??而胞質(zhì)內(nèi)ＤＮＡ的受體識別是研究發(fā)現(xiàn)ＤＮＡ胞膜受體——Ｔｏｌｌ樣受（ｔｏｌＷｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ９ＴＬＲ９）之后［３］，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)數(shù)種ＤＮＡ胞質(zhì)受體，如ＤＮＡ依賴擾素調(diào)節(jié)因子激活物（ＤＡＩ）［１Ｇ］、ＲＮＡ?聚合酶?ＩＩＩ（ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ?ＩＩＩ，Ｐｏｌ?ＩＩＩ）、ＡＩ樣蛋白（ＡＩＭ２－ｌｉｋｅ?ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＡＬＲ）家族、富亮氨酸重復序列相互作用（Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ?ｒｅｐｅａｔ?ｆｌｉｇｈｔｌｅｓｓ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ?ｐｒｏｔｅｉｎ?１，?ＬＲＲＦＩＰ１?）、ＤＥｘ?Ｄ?／?Ｈ?解旋族、ＤＮＡ依賴性蛋白激酶（ＤＮＡ?ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｋｉｎａｓｅ，ＤＮＡ－ＰＫ）、干擾素刺因（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ?ｏｆ?ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ?ｇｅｎｅ，ＳＴＩＮＧ）、環(huán)鳥苷酸－腺苷酸合成酶（ｃｙｃｌｉｃ?ＧＭＰ－Ａｓｙｎｔｈａｓｅ，ｃＧＡＳ）、ＤＮＡ?修復相關(guān)蛋白?Ｒａｄ５０?及轉(zhuǎn)錄因子?Ｓｏｘ２（ｓｒｙ－ｒｅｌａｔｅｄＨＭＧ２）［３．５］等。??下面著重介紹ｄｓＤＮＡ識別受體環(huán)鳥苷酸－腺苷酸合成酶ＣＧＡＳ與干擾素刺因（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ?ｏｆ?ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ?ｇｅｎｅ，?ＳＴＩＮＧ）的天然免疫信號通路。??

ｃＧＡＳ和ＳＴＩＮＧ還可以跨不同的細胞協(xié)作，以水平方式傳播抗病毒免疫應(yīng)答。這??種轉(zhuǎn)移過程要么依賴于ｃＧＡＭＰ的間隙連接依賴傳遞，要么通過將ｃＧＡＭＰ打包成病??毒顆粒（圖２）［２７－２９］�？傊ㄟ^ＤＮＡ檢測，ｃＧＡＳ產(chǎn)生ｃＧＡＭＰ，激活ＳＴＩＮＧ。激活??后，ＳＴＩＮＧ退出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，加入ＴＢＫ１和ＩＲＦ－３。磷酸化的ＩＲＦ－３二聚并轉(zhuǎn)位到細胞核??１０??

改造后的ＶＣ０１７９－ＡＬＯＯＰ基因序列：??ａｔｇａｇａａｔｇａ?ｃｔｔｇｇａａｃｔｔ?ｔｃａｃｃａｇｔａｃ?ｔａｃａｃａａａｃｃ?ｇａａａｔｇａｔｇｇ?ｃｔｔｇａｔｇｇｇｃ?６０??ａａｇｃｔａｇｔｔｃ?ｔｔａｃａｇａｃｇａ?ｇｇａｇａａｇａａｃ?ａａｔｃｔａａａｇｇ?ｃａｔｔｇｃｇｔａａ?ｇａｔｃａｔｃｃｇｃ?１２０??ｔｔａａｇａａｃａｃ?ｇａｇａｔｇｔａｔｔ?ｔｇａａｇａａｇｃｔ?ａａｇｇｇｔａｔｔｇ?ｃｃａａｇｇｃｔｇｔ?ｇａａａａａａａｇｔ?１８０??ｇｃｔｃｔｔａｃｇｔ?ｔｔｇａａａｔｔａｔ?ｔｃａｇｇａａａａｇ?ｇｔｇｔｃａａｃｇａ?ｃｃｃａａａｔｔａａ?ｇｃａｃｃｔｔｔｃｔ?２４０??ｇａｃａｇｃｇａａｃ?ａａｃｇａｇａａｇｔ?ｇｇｃｔａａｇｃｔｔ?ａｔｔｔａｃｇａｇａ?ｔｇｇａｔｇａｔｇａ?ｔｇｃｔｃｇｔｇａｔ?３００??ｇａｇｔｔｔｔｔｇｇ?ｇａｔｔｇａｃａｃｃ?ｔｃｇｃｔｔｔｔｇｇ?ａｃｔｃａｇｇｇａａ?ｇｃｔｔｔｃａｇｔａ?ｔｇａｃａｃｇｃｔｇ?３６０??ａａｔｃｇｃｃｃｇｔ?ｔｔｃａｇｃｃｔｇｇ?ｔｃａａｇａａａｔｇ?ｇａｔａｔｔｇａｔｇ?ａｔｇｇａａｃｃｔａ?ｔａｔｇｃｃａａｔｇ?４２０??ｃｃｔａｔｔｔｔｔｇ?ａｇｔｃａｇａｇｃｃ?ｔａａｇａｔｔｇｇｔ?ｃａｔｔｃｔｔｔａｃ?ｔａａｔｔｃｔｔｃｔ?ｔｇｔｔｇａｃｇｃｇ?４８０??ｔｃａｃｔｔａａｇｔ?ｃａｃｔｔｇｔａｇｃ?ｔｇａａａａｔｃａｔ?ｇｇｃｔｇｇａａａｔ?ｔｔｇａａｇｃｔａａ?ｇｃａｇａｃｔｔｇｔ?５４０??ｇｇｇａｇｇａｔｔａ?ａｇａｔｔｇａｇｇｃ?ａｇａｇａａａａｃａ?ｃａｔａｔｔｇａｔｇ?ｔａｃｃａａｔｇｔａ?ｔｇｃａａｔｃｃｃｔ?６００??ａ

本文編號：2865227