胚胎附植是哺乳動物繁殖的一個關鍵環(huán)節(jié),胚胎附植前后,胚胎和母體內部的基因和蛋白的表達都會發(fā)生改變,這一過程受很多因子調控。miRNAs作為一類內源性的具有調控功能的因子,對胚胎附植過程具有重要調控作用。然而在豬中關于miRNAs對胚胎附植過程的影響及機制研究報道較少。通過早期研究分析發(fā)現(xiàn)miR-21在豬胚胎附植期子宮內膜組織中高表達且差異表達,而以往關于miR-21的報道多集中于腫瘤方面。本文為探究miR-21對豬胚胎附植的影響,以早期妊娠母豬為實驗對象,先檢測了豬妊娠早期3個時期(9d、12d、15d)及空懷12d天的子宮內膜組織中miR-21的表達量,然后運用雙熒光酶報告檢測、Annexin V-FITC流式檢測、Transwell檢測、小鼠子宮角注射、qRT-PCR和Western Blot等實驗技術方法探究miR-21及其靶基因PDCD4在豬早期胚胎附植過程中的作用及分子機制。本研究對了解豬胚胎附植的分子調控機制以及養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟效益的提高具有重要意義。主要研究結果如下:1.qRT-PCR技術檢測豬妊娠9d、12d、15d及空懷第12d天的子宮內膜組織中miR-21的表達情況,結果表明miR-21在妊娠12d相對表達量最高,且妊娠12d與妊娠9d及空懷第12d表達量差異均顯著。2.Annexin V-FITC流式檢測結果表明,抑制miR-21的表達,會促進豬子宮內膜細胞凋亡;Transwell檢測結果表明,抑制miR-21的表達,會抑制豬子宮內膜細胞遷移。3.生物學信息預測miR-21靶向PDCD4基因,雙熒光報告基因驗證miR-21能夠結合PDCD4 3’UTR抑制報告基因的表達,qRT-PCR和Western Blot結果表明miR-21可以在翻譯水平負調控PDCD4的表達。4.Annexin V-FITC流式和Transwell檢測結果表明,抑制PDCD4的表達(轉染PDCD4 siRNA)能夠抑制豬子宮內膜細胞凋亡,促進細胞遷移。補充外源PDCD4siRNA則能夠減弱抑制miR-21 inhibitor引起的促進子宮內膜細胞凋亡和回復miR-21 inhibitor引起的抑制細胞遷移作用。5.qRT-PCR檢測結果表明,抑制miR-21的表達,會顯著下調轉化生長因子TGF-β的表達,而抑制PDCD4基因的表達,會顯著上調TGF-β基因的表達。6.小鼠活體子宮角注射試驗結果表明,注射miR-21的干涉片段后,小鼠胚胎附植數(shù)目明顯減少。綜上所述,下調miR-21后,會直接靶向PDCD4基因促進豬子宮內膜細胞凋亡,抑制細胞遷移;同時抑制胚胎附植標志基因TGF-β的表達。另外下調miR-21,會直接影響小鼠的胚胎著床,不利于胚胎附植。推測miR-21對豬早期胚胎附植可能具有重要作用。
【學位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

鼠以及豬等多種哺乳動物中，均有大量研究證實 LIF 基因在妊娠早期胚胎附植中高表達，可以促進滋養(yǎng)層和子宮內膜細胞的增殖、遷移并受到雌激素和孕激調節(jié)，此外敲除 LIF 基因的小鼠胚胎只能發(fā)育到胚泡期從而導致胚胎附植失(Stewart 1994，Laird et al 1997，Blitek et al 2012b）。此外，表皮生長因子受體（EG和它們的配體家族已被發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎附植期子宮子宮的表達模式，結果顯EGFR 家族受體與配體的信號傳導對胚胎附植極為重要，可以影響囊胚的生長及基質細胞的增殖(Lim et al 1997）。在豬妊娠第 13-14 天胚胎附植前期 EGFR mR和蛋白水平在子宮內膜腔及腺體上皮均強烈表達，促進子宮內膜細胞的遷移(Jet al 2016a），以及 HB-EGF、IL-6、VEGF、BMP2 等基因都被認為對豬胚胎附植有重要作用。它們在子宮胚胎附植期間都強烈表達且與非附植點差異表達(Bliteal 2012c，Chen et al 2015）。對豬早期胚胎附植標志基因的研究，可以幫助我定與胚胎著床相關的候選基因，對于理解基因調控胚胎附植過程的細胞和分子礎研究具有重要意義，也可以作為豬產(chǎn)仔數(shù)遺傳標記研究的資源。

-21 通過靶向 PDCD4 調控豬子宮內膜細胞凋亡、遷移的作用機理研究妊娠早期子宮內膜組織的表達-21 在豬早期胚胎附植過程中的相對表達情況，采9 d、12 d 和 15 d）及空懷 12d 的子宮內膜組織的術檢測 miR-21 在豬子宮內膜組織中的相對表達 12d，miR-21 基因的表達量最高，且與空懷 12d在這三個時期，miR-21 的表達量先升高，再降 表達量最高。結果表明 miR-21 在豬胚胎附植早

圖 3-2 不同處理后 miR-21 的相對表達量（A）轉染 inhibitor（B）轉染 mimicsFig 3-2 The miR-21 expression levels were measured by qRT-PCR for the different treatgroups(A)Transfecting inhibitor.(B)Transfecting mimics3.2.2 miR-21 對豬子宮內膜細胞凋亡的影響許多研究都顯示，細胞活力的增強或減弱與細胞凋亡增強或減弱有關。而豬子宮內膜細胞的凋亡和胚胎附植密切相關(Lim et al 2018）。為了研究 miR-21 對豬子宮內膜細胞凋亡的影響，分別轉染 miR-21 小片段，結果如圖 3-4 所示，象限一、二、三、四分別表示晚期凋亡細胞、機械損傷細胞、正�；罴毎�、早期凋亡細胞，檢測細胞凋亡數(shù)以早期凋亡和晚期凋亡細胞的總和來判定，結果顯示，miR-21inhibitor 組細胞比例顯著低于對照組（P<0.05）；而 miR-21 mimic 組細胞與對照組無顯著差異（圖 3-4），我們猜測 miR-21 本身在正常健康子宮內膜細胞中表達量較高，因此過表達后，其效果并不明顯。這些結果表明 miR-21inhibitor 會促進細胞凋
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本文編號：2862737