胚胎附植是哺乳動(dòng)物繁殖的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié),胚胎附植前后,胚胎和母體內(nèi)部的基因和蛋白的表達(dá)都會(huì)發(fā)生改變,這一過(guò)程受很多因子調(diào)控。miRNAs作為一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的因子,對(duì)胚胎附植過(guò)程具有重要調(diào)控作用。然而在豬中關(guān)于miRNAs對(duì)胚胎附植過(guò)程的影響及機(jī)制研究報(bào)道較少。通過(guò)早期研究分析發(fā)現(xiàn)miR-21在豬胚胎附植期子宮內(nèi)膜組織中高表達(dá)且差異表達(dá),而以往關(guān)于miR-21的報(bào)道多集中于腫瘤方面。本文為探究miR-21對(duì)豬胚胎附植的影響,以早期妊娠母豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,先檢測(cè)了豬妊娠早期3個(gè)時(shí)期(9d、12d、15d)及空懷12d天的子宮內(nèi)膜組織中miR-21的表達(dá)量,然后運(yùn)用雙熒光酶報(bào)告檢測(cè)、Annexin V-FITC流式檢測(cè)、Transwell檢測(cè)、小鼠子宮角注射、qRT-PCR和Western Blot等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法探究miR-21及其靶基因PDCD4在豬早期胚胎附植過(guò)程中的作用及分子機(jī)制。本研究對(duì)了解豬胚胎附植的分子調(diào)控機(jī)制以及養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的提高具有重要意義。主要研究結(jié)果如下:1.qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)豬妊娠9d、12d、15d及空懷第12d天的子宮內(nèi)膜組織中miR-21的表達(dá)情況,結(jié)果表明miR-21在妊娠12d相對(duì)表達(dá)量最高,且妊娠12d與妊娠9d及空懷第12d表達(dá)量差異均顯著。2.Annexin V-FITC流式檢測(cè)結(jié)果表明,抑制miR-21的表達(dá),會(huì)促進(jìn)豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡;Transwell檢測(cè)結(jié)果表明,抑制miR-21的表達(dá),會(huì)抑制豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞遷移。3.生物學(xué)信息預(yù)測(cè)miR-21靶向PDCD4基因,雙熒光報(bào)告基因驗(yàn)證miR-21能夠結(jié)合PDCD4 3’UTR抑制報(bào)告基因的表達(dá),qRT-PCR和Western Blot結(jié)果表明miR-21可以在翻譯水平負(fù)調(diào)控PDCD4的表達(dá)。4.Annexin V-FITC流式和Transwell檢測(cè)結(jié)果表明,抑制PDCD4的表達(dá)(轉(zhuǎn)染PDCD4 siRNA)能夠抑制豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞遷移。補(bǔ)充外源PDCD4siRNA則能夠減弱抑制miR-21 inhibitor引起的促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡和回復(fù)miR-21 inhibitor引起的抑制細(xì)胞遷移作用。5.qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,抑制miR-21的表達(dá),會(huì)顯著下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β的表達(dá),而抑制PDCD4基因的表達(dá),會(huì)顯著上調(diào)TGF-β基因的表達(dá)。6.小鼠活體子宮角注射試驗(yàn)結(jié)果表明,注射miR-21的干涉片段后,小鼠胚胎附植數(shù)目明顯減少。綜上所述,下調(diào)miR-21后,會(huì)直接靶向PDCD4基因促進(jìn)豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞遷移;同時(shí)抑制胚胎附植標(biāo)志基因TGF-β的表達(dá)。另外下調(diào)miR-21,會(huì)直接影響小鼠的胚胎著床,不利于胚胎附植。推測(cè)miR-21對(duì)豬早期胚胎附植可能具有重要作用。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

鼠以及豬等多種哺乳動(dòng)物中，均有大量研究證實(shí) LIF 基因在妊娠早期胚胎附植中高表達(dá)，可以促進(jìn)滋養(yǎng)層和子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、遷移并受到雌激素和孕激調(diào)節(jié)，此外敲除 LIF 基因的小鼠胚胎只能發(fā)育到胚泡期從而導(dǎo)致胚胎附植失(Stewart 1994，Laird et al 1997，Blitek et al 2012b）。此外，表皮生長(zhǎng)因子受體（EG和它們的配體家族已被發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎附植期子宮子宮的表達(dá)模式，結(jié)果顯EGFR 家族受體與配體的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)胚胎附植極為重要，可以影響囊胚的生長(zhǎng)及基質(zhì)細(xì)胞的增殖(Lim et al 1997）。在豬妊娠第 13-14 天胚胎附植前期 EGFR mR和蛋白水平在子宮內(nèi)膜腔及腺體上皮均強(qiáng)烈表達(dá)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移(Jet al 2016a），以及 HB-EGF、IL-6、VEGF、BMP2 等基因都被認(rèn)為對(duì)豬胚胎附植有重要作用。它們?cè)谧訉m胚胎附植期間都強(qiáng)烈表達(dá)且與非附植點(diǎn)差異表達(dá)(Bliteal 2012c，Chen et al 2015）。對(duì)豬早期胚胎附植標(biāo)志基因的研究，可以幫助我定與胚胎著床相關(guān)的候選基因，對(duì)于理解基因調(diào)控胚胎附植過(guò)程的細(xì)胞和分子礎(chǔ)研究具有重要意義，也可以作為豬產(chǎn)仔數(shù)遺傳標(biāo)記研究的資源。

-21 通過(guò)靶向 PDCD4 調(diào)控豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡、遷移的作用機(jī)理研究妊娠早期子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)-21 在豬早期胚胎附植過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)情況，采9 d、12 d 和 15 d）及空懷 12d 的子宮內(nèi)膜組織的術(shù)檢測(cè) miR-21 在豬子宮內(nèi)膜組織中的相對(duì)表達(dá) 12d，miR-21 基因的表達(dá)量最高，且與空懷 12d在這三個(gè)時(shí)期，miR-21 的表達(dá)量先升高，再降 表達(dá)量最高。結(jié)果表明 miR-21 在豬胚胎附植早

圖 3-2 不同處理后 miR-21 的相對(duì)表達(dá)量（A）轉(zhuǎn)染 inhibitor（B）轉(zhuǎn)染 mimicsFig 3-2 The miR-21 expression levels were measured by qRT-PCR for the different treatgroups(A)Transfecting inhibitor.(B)Transfecting mimics3.2.2 miR-21 對(duì)豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響許多研究都顯示，細(xì)胞活力的增強(qiáng)或減弱與細(xì)胞凋亡增強(qiáng)或減弱有關(guān)。而豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡和胚胎附植密切相關(guān)(Lim et al 2018）。為了研究 miR-21 對(duì)豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響，分別轉(zhuǎn)染 miR-21 小片段，結(jié)果如圖 3-4 所示，象限一、二、三、四分別表示晚期凋亡細(xì)胞、機(jī)械損傷細(xì)胞、正�；罴�(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)以早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的總和來(lái)判定，結(jié)果顯示，miR-21inhibitor 組細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；而 miR-21 mimic 組細(xì)胞與對(duì)照組無(wú)顯著差異（圖 3-4），我們猜測(cè) miR-21 本身在正常健康子宮內(nèi)膜細(xì)胞中表達(dá)量較高，因此過(guò)表達(dá)后，其效果并不明顯。這些結(jié)果表明 miR-21inhibitor 會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋
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