FOXL2是叉頭狀轉錄因子超家族的成員之一,在卵泡顆粒細胞中表達,對卵巢分化、發(fā)育和維持起重要的調控作用。在本課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn),雞FOXL2最早在E4.5天開始表達,暗示其在雞性別決定和性腺分化過程中可能發(fā)揮重要的調控作用;隨后在成年母雞中隨著卵泡發(fā)育,FOXL2在小白卵泡中低表達、在等級前卵泡顆粒細胞表達升高、在排卵前卵泡顆粒細胞再度升高,暗示在卵泡的發(fā)育過程中,FOXL2同樣可能發(fā)揮重要的調控作用;為此本研究的主要目是研究FOXL2在卵泡顆粒細胞維持中的作用,以及研究異位表達FOXL2對雞胚睪丸支持細胞影響。研究結果如下:1.構建了具有較高過表達效率的pcDNA3.1-FOXL2過表達載體,DF-1細胞轉染24 h后通過定量PCR檢查FOXL2的相對過表達效率達1200多倍。2.轉染pcDNA3.1-FOXL2載體后通過CCK8和ATP方法檢測FOXL2對排卵前顆粒細胞(po-GC)增殖的影響。結果顯示:轉染pcDNA3.1-FOXL2 48h組的細胞活力顯著低于pcDNA3.1組和空白組,表明過表達FOXL2抑制排卵前顆粒細胞增殖;轉染48h過表達FOXL2組G1期的細胞比例顯著升高,而S期和G2期細胞則顯著降低以及凋亡第二和第三象限細胞比例顯著性升高,說明過表達FOXL2可抑制po-GC的周期進展,促進細胞凋亡。3.為進一步了解過表達FOXL2對po-GC的促凋亡機制,通過qPCR檢測凋亡TNF-α/NF-ΚB和JNK/MAPK信號通路基因,結果發(fā)現(xiàn):過表達FOXL2能顯著上調TNF-α、TNFSF10、FADD、BAK1、DAB21P、MAP3K7、FAS、MAP3K5、C-JUN、MAPK8、MAPK9、CASP8和CASP10等促凋亡基因,推測過表達FOXL2對排卵前顆粒細胞的促凋亡作用,主要是通過激活了JNK/TNF-α信號通路。用細胞免疫熒光檢測過表達FOXL2后p65的細胞定位,結果發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)的po-GC不管過表達FOXL2與否,p65均入核表達,說明此次離體培養(yǎng)的po-GC自主激活了NF-ΚB細胞通路。4.軟件預測FOXL2是miR-1329-3p的靶基因。通過等級前顆粒細胞(ph-GC)和排卵前顆粒細胞,miR-1329-3p和FOXL2的相對定量表達模式分析,發(fā)現(xiàn)兩者呈相反表達模式,初步推斷FOXL2是miR-1329-3p的靶基因。雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn),miR-1329-3p能夠與FOXL2 CDS的種子序列結合,顯著性抑制FOXL2 CDS區(qū)域的報告基因活性。qPCR和Western blot研究發(fā)現(xiàn),在轉染顆粒細胞中,miR-1329-3p過表達能顯著抑制FOXL2 mRNA及蛋白質的表達,同時抑制miR-1329-3p后的結果與過表達剛好相反。結果表明在顆粒細胞中,miR-1329-3p能通過靶向FOXL2 CDS種子序列負調控FOXL2的表達。5.在雞睪丸支持細胞中進行FOXL2的過表達,利用放射性免疫的方法檢測了細胞上清雌二醇(E2)、孕酮(P)和睪酮(T)的含量,發(fā)現(xiàn)E2濃度顯著性上調,而P、T無顯著性變化;定量PCR檢測轉染后性腺分化發(fā)育相關基因的表達,發(fā)現(xiàn)過表達FOXL2可引起睪丸分化或發(fā)育相關基因SOX9、DMRT1、STAT3表達量顯著性下調,而卵巢發(fā)育相關的CYP19A1和WNT4、CTNNB1(即WNT4/β-catenin信號通路)基因顯著性上調。為進一步分析WNT4/β-catenin信號通路在此過程中被激活的作用,構建了pcDNA3.1-WNT4和pcDNA3.1-CTNNB1過表達載體,發(fā)現(xiàn)過表達WNT4或CTNNB1,除了DMRT1不受影響,SOX9和STAT3表達量均顯著下調,CYP19A1表達量顯著性上調,這與FOXL2過表達作用基本一致,初步確定WNT4/β-catenin信號通路的激活同F(xiàn)OXL2發(fā)揮協(xié)同作用。過表達WNT4或CTNNB1后FOXL2和CTNNB1或WNT4的表達也顯著性上調,這說明FOXL2,WNT4和β-catenin三者間存在互作關系。進一步分析過表達FOXL2是否是通過WNT4/β-catenin信號通路發(fā)揮作用,利用siRNA干擾β-catenin發(fā)現(xiàn)SOX9的表達量顯著上升,FOXL2和WNT4、CYP19A1的表達量顯著降低,而DMRT1和STAT3的表達無顯著性變化;在過表達FOXL2同時敲低β-catenin發(fā)現(xiàn),與單獨過表達FOXL2組相比,共轉染組SOX9的表達量顯著性上調,CYP19A1表達量顯著性下調,而DMRT1和STAT3表達量差異不顯著,這說明過表達FOXL2對SOX9的抑制作用主要是通過WNT4/β-catenin信號通路,且該通路協(xié)同F(xiàn)OXL2激活CYP19A1的表達,但并非主要途徑。6.構建了雞胚E4.5-E18.5性腺FOXL2和CTNNB1的表達譜,發(fā)現(xiàn)FOXL2呈雌性特異性表達,且E4.5開始表達,隨日齡表達量逐漸升高;CTNNB1表達不呈顯著性別趨勢,E4.5開始表達,推測CTNNB1在睪丸發(fā)育中同樣發(fā)揮重要作用。
【學位單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S831
【部分圖文】：

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雞 FOXL2 對卵泡顆粒細胞維持的作用及其異位表達對睪丸支持細胞的影響1.3 研究目的與意義FOXL2 對雞顆粒細胞和卵巢分化具有重要的維持和分化作用，本研究旨在通過成熟顆粒細胞中過表達 FOXL2，檢測對細胞增殖、周期及凋亡的影響及相關機制，進一步闡明雞 FOXL2 對成熟顆粒細胞的維持作用；此外，研究 miRNA 對 FOXL2在顆粒細胞的調控作用，補充雞 FOXL2 miRNA 研究的空白；同時在支持細胞中異位表達 FOXL2，旨在研究 FOXL2 對雞胚性腺分化的影響。1.4 研究技術路線

<B pcDNA3.1(+)和 psiCHECKTM-2 載體質粒的酶切和片段回收分 別 利 用 BamH I 和 Xho I 以 及 Not I 和 Xho I 分 別 對 pcDNA3.1(+) 和psiCHECKTM-2 載體質粒進行雙酶切（質粒圖譜如圖 2-1）：雙酶切反應體系如下：10* NEBuffer 5 μLXhoI 1 μLBamH I 或 Not I 1 μLpcDNA3.1(+)或 psiCHECKTM-2 質粒 1 uL(1μg)ddH2O 42 μL總體積 50 μL37℃ PCR 儀中酶切 30min，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，檢測目的片段正確后，進行回收，回收步驟參照 2.3.1.1。
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本文編號：2861045