發(fā)布時間：2020-10-28 04:09

　　 胎盤血管的密度和大小決定著胎盤功能,對影響母豬的生產(chǎn)性能具有重大意義,研究胎盤血管的形成對改善母豬生產(chǎn)性能和胚胎健康生長具有重要價值。精胺是由細(xì)胞合成的,廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)脂肪族胺類,對細(xì)胞的增殖分化具有重要作用。本項目旨在應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)技術(shù)手段,從分子和細(xì)胞水平研究外源精胺對豬臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管形成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響,以及血管形成相關(guān)信號通路位點的基因表達(dá)。為尋找防止母豬胎盤功能不全帶來的仔豬宮內(nèi)發(fā)育遲緩的方法提供理論支持。為此,本項目展開如下試驗:1.以正常分娩的豬臍帶為材料,通過采用I型膠原酶灌注臍靜脈,37℃消化15min,具有較好的內(nèi)皮細(xì)胞分離效果。采用高濃度血清,促進(jìn)原代細(xì)胞的生長。分離純化后的內(nèi)皮細(xì)胞通過形態(tài)學(xué)和抗CD31,抗vWF蛋白染色鑒定其為內(nèi)皮細(xì)胞。2.不同濃度(0μM、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM)的精胺不同程度的影響豬臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,7.5μM精胺添加量對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用最大(P0.05)。以7.5μM精胺添加量為試驗組進(jìn)行細(xì)胞遷移和管腔形成試驗。7.5μM精胺處理組中細(xì)胞遷移數(shù)量與管腔形成數(shù)量顯著高于(P0.05)對照組。添加7.5μM精胺能夠促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外血管形成。3.通過熒光定量PCR技術(shù)檢測對照組和7.5μM精胺處理組中FGF-2、PLGF、ANG-1、VEGF-A、PI3K、AKT1、m-TOR、S6K1、MEK基因表達(dá)量。熒光定量結(jié)果表明7.5μM精胺處理組FGF-2、PLGF、m-TOR、MEK的基因表達(dá)量顯著高于對照組(P0.05)。
【學(xué)位單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S828.5
【部分圖文】：

試驗一 豬臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)2 結(jié)果與分析2.1 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果如圖。用I型膠原酶消化15min，可以獲得數(shù)量較多的團塊狀細(xì)胞，團塊細(xì)胞易貼壁，細(xì)胞向四周展開，細(xì)胞成活率高，活力強，4天左右鋪層，適合用于后期的實驗。細(xì)胞接種6小時后，部分細(xì)胞開始貼壁展開生長，細(xì)胞呈現(xiàn)短梭型，圍繞著團塊細(xì)胞為中心向周圍四散鋪開，培養(yǎng)基略微混雜，培養(yǎng)基中有大量死細(xì)胞，未貼壁的細(xì)胞團塊。培養(yǎng)1天后首次換液，顯微鏡下觀察細(xì)胞呈現(xiàn)不同大小的成團細(xì)胞，些許貼壁的點狀雜質(zhì)，換液能去除。培養(yǎng)第3天，細(xì)胞迅速增殖連接成片，細(xì)胞核清晰明顯，細(xì)胞輪廓形狀略微變模糊。培養(yǎng)至第4天，細(xì)胞鋪滿瓶底，細(xì)胞形態(tài)清晰，大小均一，呈現(xiàn)明顯的鋪路石樣。AB

外源精胺對豬臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的影響及其作用機理2.2 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離免疫熒光鑒定結(jié)果細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，細(xì)胞特異性表達(dá)韋伯小體蛋白 vWF 和血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子CD31多克隆抗體和Cy3標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白IgG染色后，在暗視野內(nèi)，經(jīng)過綠光激發(fā)后，顯現(xiàn)出紅色，呈陽性，細(xì)胞核 DAPI 熒光染色呈現(xiàn)出藍(lán)色。明視野內(nèi)，細(xì)胞呈現(xiàn)短梭形，成鋪路石狀生長�？瞻讓φ占�(xì)胞不顯現(xiàn)出紅色熒光，陽性對照細(xì)胞顯現(xiàn)出紅色熒光。證明分離所獲得的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。從免疫熒光鑒定結(jié)果可以看出，細(xì)胞表現(xiàn)出強陽性，說明臍靜脈用 I 型膠原酶 37℃下消化 15min 能獲得純度較高的血管內(nèi)皮細(xì)胞。

圖 2-3 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)與 OD 值的關(guān)系Fig 2-3 Relationship between the number of umbilical vein endothelial cells and OD圖 2-4 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線Fig 2-4 The cell growth curve of umbilical vein endothelial
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本文編號：2859566