發(fā)布時間：2020-10-26 14:18

　　 J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(Subgroup J Avian Leukosis Virus,ALV-J)引起的腫瘤性傳染性疾病。ALV-J自1988年在英國被發(fā)現(xiàn)并鑒定以來,迅速傳播到其他國家及地區(qū),在世界范圍內(nèi)廣泛流行,遍布全部的養(yǎng)雞國家。ALV-J既可水平傳播,又可垂直傳播。J亞群禽白血病主要臨床表現(xiàn)為多種腫瘤性病變,導(dǎo)致雞的體重增長緩慢、雞群的產(chǎn)蛋率下降、免疫抑制等,給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。我國自1999年在商品代肉雞中分離并鑒定出ALV-J以來,ALV-J在我國雞群中普遍流行,并且擴散到中國地方品系雞群,逐漸成為近些年危害最嚴(yán)重的傳染病之一。建立準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測技術(shù)進行種群凈化,是控制ALV-J的有效措施。目前,ALV病原檢測普遍使用檢測P27的ELISA試劑盒,然而在抗體檢測方面,ALV-J抗體檢測試劑盒非特異性較高,檢測效果不穩(wěn)定。因此有必要研制一種準(zhǔn)確、快速、靈敏的試紙條,用來檢測ALV-J抗體。1、鼠抗雞IgG單克隆抗體的制備利用飽和硫酸銨沉淀法和葡聚糖凝膠純化法分離雞血清的IgG,并用SDS-PAGE電泳分析鑒定雞IgG的純度。將獲得的雞IgG免疫7周齡BALB/C小鼠,每次間隔15d,第三次免疫后,取小鼠脾臟,采集脾臟細胞,與處于對數(shù)生長期的SP2/0細胞進行融合。通過ELISA方法篩選和三次亞克隆得到四株能夠穩(wěn)定分泌抗雞IgG抗體的雜交瘤細胞,分別命名為CIgG-1H7、CIgG-2C9、CIgG--3G、CIgG-5B3�？贵w亞類鑒定結(jié)果表明CIgG-1H7、CIgG-3G3、CIgG-5B3亞型均為IgG1,CIgG-2C9為IgG2a,四株單克隆抗體輕鏈亞類均為κ型。用間接ELISA方法測定小鼠腹水效價,結(jié)果為1:80000～1:320000。Western blot分析顯示四株單克隆抗體均與雞IgG重鏈反應(yīng)。經(jīng)過ELISA實驗分析CIgG-1H7、CIgG-2C9與其他動物IgG無交叉反應(yīng)。間接免疫熒光試驗結(jié)果顯示CIgG-3G3和CIgG-5B3兩株單抗具有較好的熒光反應(yīng)性。本研究中所制備的單克隆抗體為雞病診斷試劑的研發(fā)提供了可靠的材料。2、ALV-J抗體快速檢測試紙條的研制本研究在鑒定并明確ALV-J囊膜蛋白gp85特異性抗原表位的基礎(chǔ)上,利用合成肽作為抗原建立檢測血清中ALV-J特異性抗體。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),選擇多肽ALV-J-P2作為抗原,噴繪于NC膜上作為試紙條的檢測線;選擇研究內(nèi)容一中制備的CIgG-5B3單抗作為金標(biāo)抗體,制備了膠體金-抗體偶聯(lián)復(fù)合物,噴涂于試紙條的金標(biāo)墊上;使用商品化羊抗鼠IgG作為質(zhì)控線的抗體。最終通過噴繪、組裝、切條等步驟,制備了一批能夠快速、靈敏、簡單地檢測出血清中ALV-J特異性抗體的試紙條。該試紙條可以檢測出人工感染ALV-J JS09GY07病毒株雞血清中的抗體。
【學(xué)位單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

也逐步被挖掘出來［４４】。??２．１免疫膠體金技術(shù)的基本原理??氯金酸（ＨＡｕＣＵ）在還原劑的作用下，產(chǎn)生一定大小的金顆粒。如圖１，膠體金顆粒??的結(jié)構(gòu)包括位于中心的金核和雙離子層，金顆粒表面包圍著陰性電離子層（Ｚｅｔａ電位），金??顆粒表面的八１１（：１２＿離子層與Ｈ＋離子層分散均勻。由于靜電作用使得膠體金顆粒之間有相??互排斥作用，所以能夠維持膠體狀態(tài)。膠體金顆粒并不是完美的圓球體，直徑小于３０?ｒｎｎ??的膠體金顆粒多為是圓球體的，而較大的膠體金顆粒的形狀大多為橢球體，可以通過電子??顯微鏡觀察膠體金顆粒的大小和形態(tài)［４５］。??

圖１．１?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析雞ＩｇＧ純化的效果??Ｍ：普通蛋白ｍａｋｅｒ?１：純化的雞ＩｇＧ??Ｆｉｇ．?１．１?Ｔｈｅ?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ｃｈｉｃｋｅｎ?ＩｇＭ：普通蛋白?ｍａｋｅｒ?１?：?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ｃｈｉｃｋｅｎ?ＩｇＧ??抗體雜交株細胞的建立??測融合后的細胞上清，選取〇Ｄ值判定為陽凍存及亞克隆。三次亞克隆之后得到４株穩(wěn)分別命名為ＣＩｇＧ－ｌＨ７、ＣＩｇＧ－２Ｃ９、ＣＩｇＧ－３Ｇ３定??對上述單克隆抗體亞類進行了鑒定，結(jié)果為Ｃ

我鳥?ＩｇＧ?０．０５９?０．０６５?０．０６３?０．２６８?０．２７５??兔?ＩｇＧ?０．０７４?０．０８４?０．０８２?０．０８２?０．０７８??對制備的四株單克隆抗體的反應(yīng)性進行Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ驗證，如圖１．２，?１．３，?１．４，１．５，??１．６，四株單克隆抗體與雞ＩｇＧ的反應(yīng)性較好，結(jié)合雞ＩｇＧ的重鏈。??ｋＤ?Ｍ?１?２?３?４??ｉ?ｐｎ??５０?％■?．?．?Ｐ，??３５??２５??２０?？，場??圖１．２血清ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖??Ｆｉｇ?１．２?Ｔｈｅ?ＳＤＳ?ｐａｇｅ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｓｅｒｕｍ??Ｍ：?Ｍａｋｅｒ，Ｎ４：雞、鴨、鵝、兔血清??Ｍ：?Ｍａｋｅｒ?１－４：?ｃｈｉｃｋｅｎ、ｄｕｃｋ、ｇｅｅｓｅ、ｒａｂｂｉｔ?ｓｅｒｕｍ??
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙良娟;張霞;劉國紅;鄭文杰;;可視化核酸試紙條法快速檢測肉及肉制品中鴨源成分[J];食品研究與開發(fā);2018年02期

2 朱麗君;董雯雯;馬寧寧;周建波;袁艷梅;盧亞平;李宗瑞;魏凱;王海榮;朱瑞良;;ALV-J不同接種途徑誘導(dǎo)SPF雞免疫抑制狀況的比較分析[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2017年11期

3 胡海;錢琨;張丹陽;石亞運;張杰;邵紅霞;金文杰;秦愛建;;禽白血病病毒衣殼蛋白p27基因絕對定量PCR方法的建立及應(yīng)用[J];中國家禽;2015年20期

4 邵紅霞;史榮華;郭卉;呂亞楠;涂飛;錢琨;金文杰;葉建強;秦愛建;;抗鵝IgG單克隆抗體的研制及其特性研究[J];中國家禽;2015年15期

5 胡曉苗;沈?qū)W懷;戴銀;趙瑞宏;侯宏艷;潘孝成;周學(xué)利;張丹俊;朱傳明;;PCR法檢測活毒疫苗中禽白血病病毒污染[J];中國獸醫(yī)雜志;2014年09期

6 劉雅寧;袁寶鳳;;農(nóng)藥殘留膠體金檢測方法在蔬菜生產(chǎn)中的應(yīng)用研究[J];陜西農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年03期

7 聶彩輝;徐寒梅;;多肽藥物的發(fā)展現(xiàn)狀[J];藥學(xué)進展;2014年03期

8 王鑫;趙鵬;崔治中;;我國地方品種雞分離到的一個禽白血病病毒新亞群的鑒定[J];病毒學(xué)報;2012年06期

9 陳海燕;馬愛霞;陳在余;;我國抗腫瘤藥物市場現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢研究[J];北方藥學(xué);2012年11期

10 龔云飛;陳宗倫;奚茜;李沐潔;王唯芬;王旻子;應(yīng)永飛;張明洲;;三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條的研制[J];生物工程學(xué)報;2012年07期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 吳曉平;商品蛋雞源J亞群禽白血病病毒分離株生物學(xué)特性研究[D];揚州大學(xué);2010年

2 楊俊興;豬鏈球菌2型抗體檢測試紙條的制備及FBPS與宿主蛋白質(zhì)相互作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

3 秦愛建;禽白血病病毒J亞群囊膜糖蛋白基因的生物學(xué)和生物化學(xué)特性[D];揚州大學(xué);1999年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉陽;兔出血癥病毒單克隆抗體的制備及標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清的研制[D];揚州大學(xué);2017年

2 崔賀;抗原ELISA檢測試劑盒和膠體金試紙條用于禽白血病病毒檢測時的比較研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

3 石亞運;小鵝瘟病毒快速檢測試紙條的研制及其應(yīng)用[D];揚州大學(xué);2016年

4 吳元俊;廣西黑雞禽白血病的凈化與病毒株全基因組序列分析[D];廣西大學(xué);2014年

5 黃建強;雞白血病病毒與白痢沙門氏菌的混合感染[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

6 吳艷婷;雞胚成纖維細胞感染禽白血病病毒ALV-J后1號染色體微衛(wèi)星不穩(wěn)定性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

7 趙海;牛分枝桿菌主要分泌性蛋白70和脂蛋白83的克隆表達及抗原性研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

8 崔曉辰;A群輪狀病毒單克隆抗體及免疫膠體金試紙條制備[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 邢廣旭;雞新城疫病毒HN表位抗原多肽的免疫原性鑒定及應(yīng)用研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

10 趙海鋒;嗎啡膠體金免疫層析試紙條的研究與開發(fā)[D];天津大學(xué);2007年

本文編號：2857107