J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(Subgroup J Avian Leukosis Virus,ALV-J)引起的腫瘤性傳染性疾病。ALV-J自1988年在英國(guó)被發(fā)現(xiàn)并鑒定以來(lái),迅速傳播到其他國(guó)家及地區(qū),在世界范圍內(nèi)廣泛流行,遍布全部的養(yǎng)雞國(guó)家。ALV-J既可水平傳播,又可垂直傳播。J亞群禽白血病主要臨床表現(xiàn)為多種腫瘤性病變,導(dǎo)致雞的體重增長(zhǎng)緩慢、雞群的產(chǎn)蛋率下降、免疫抑制等,給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)自1999年在商品代肉雞中分離并鑒定出ALV-J以來(lái),ALV-J在我國(guó)雞群中普遍流行,并且擴(kuò)散到中國(guó)地方品系雞群,逐漸成為近些年危害最嚴(yán)重的傳染病之一。建立準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行種群凈化,是控制ALV-J的有效措施。目前,ALV病原檢測(cè)普遍使用檢測(cè)P27的ELISA試劑盒,然而在抗體檢測(cè)方面,ALV-J抗體檢測(cè)試劑盒非特異性較高,檢測(cè)效果不穩(wěn)定。因此有必要研制一種準(zhǔn)確、快速、靈敏的試紙條,用來(lái)檢測(cè)ALV-J抗體。1、鼠抗雞IgG單克隆抗體的制備利用飽和硫酸銨沉淀法和葡聚糖凝膠純化法分離雞血清的IgG,并用SDS-PAGE電泳分析鑒定雞IgG的純度。將獲得的雞IgG免疫7周齡BALB/C小鼠,每次間隔15d,第三次免疫后,取小鼠脾臟,采集脾臟細(xì)胞,與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。通過(guò)ELISA方法篩選和三次亞克隆得到四株能夠穩(wěn)定分泌抗雞IgG抗體的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為CIgG-1H7、CIgG-2C9、CIgG--3G、CIgG-5B3。抗體亞類鑒定結(jié)果表明CIgG-1H7、CIgG-3G3、CIgG-5B3亞型均為IgG1,CIgG-2C9為IgG2a,四株單克隆抗體輕鏈亞類均為κ型。用間接ELISA方法測(cè)定小鼠腹水效價(jià),結(jié)果為1:80000～1:320000。Western blot分析顯示四株單克隆抗體均與雞IgG重鏈反應(yīng)。經(jīng)過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)分析CIgG-1H7、CIgG-2C9與其他動(dòng)物IgG無(wú)交叉反應(yīng)。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示CIgG-3G3和CIgG-5B3兩株單抗具有較好的熒光反應(yīng)性。本研究中所制備的單克隆抗體為雞病診斷試劑的研發(fā)提供了可靠的材料。2、ALV-J抗體快速檢測(cè)試紙條的研制本研究在鑒定并明確ALV-J囊膜蛋白gp85特異性抗原表位的基礎(chǔ)上,利用合成肽作為抗原建立檢測(cè)血清中ALV-J特異性抗體。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),選擇多肽ALV-J-P2作為抗原,噴繪于NC膜上作為試紙條的檢測(cè)線;選擇研究?jī)?nèi)容一中制備的CIgG-5B3單抗作為金標(biāo)抗體,制備了膠體金-抗體偶聯(lián)復(fù)合物,噴涂于試紙條的金標(biāo)墊上;使用商品化羊抗鼠IgG作為質(zhì)控線的抗體。最終通過(guò)噴繪、組裝、切條等步驟,制備了一批能夠快速、靈敏、簡(jiǎn)單地檢測(cè)出血清中ALV-J特異性抗體的試紙條。該試紙條可以檢測(cè)出人工感染ALV-J JS09GY07病毒株雞血清中的抗體。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

也逐步被挖掘出來(lái)［４４】。??２．１免疫膠體金技術(shù)的基本原理??氯金酸（ＨＡｕＣＵ）在還原劑的作用下，產(chǎn)生一定大小的金顆粒。如圖１，膠體金顆粒??的結(jié)構(gòu)包括位于中心的金核和雙離子層，金顆粒表面包圍著陰性電離子層（Ｚｅｔａ電位），金??顆粒表面的八１１（：１２＿離子層與Ｈ＋離子層分散均勻。由于靜電作用使得膠體金顆粒之間有相??互排斥作用，所以能夠維持膠體狀態(tài)。膠體金顆粒并不是完美的圓球體，直徑小于３０?ｒｎｎ??的膠體金顆粒多為是圓球體的，而較大的膠體金顆粒的形狀大多為橢球體，可以通過(guò)電子??顯微鏡觀察膠體金顆粒的大小和形態(tài)［４５］。??

圖１．１?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析雞ＩｇＧ純化的效果??Ｍ：普通蛋白ｍａｋｅｒ?１：純化的雞ＩｇＧ??Ｆｉｇ．?１．１?Ｔｈｅ?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ｃｈｉｃｋｅｎ?ＩｇＭ：普通蛋白?ｍａｋｅｒ?１?：?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ｃｈｉｃｋｅｎ?ＩｇＧ??抗體雜交株細(xì)胞的建立??測(cè)融合后的細(xì)胞上清，選取〇Ｄ值判定為陽(yáng)凍存及亞克隆。三次亞克隆之后得到４株穩(wěn)分別命名為ＣＩｇＧ－ｌＨ７、ＣＩｇＧ－２Ｃ９、ＣＩｇＧ－３Ｇ３定??對(duì)上述單克隆抗體亞類進(jìn)行了鑒定，結(jié)果為Ｃ

我鳥(niǎo)?ＩｇＧ?０．０５９?０．０６５?０．０６３?０．２６８?０．２７５??兔?ＩｇＧ?０．０７４?０．０８４?０．０８２?０．０８２?０．０７８??對(duì)制備的四株單克隆抗體的反應(yīng)性進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ驗(yàn)證，如圖１．２，?１．３，?１．４，１．５，??１．６，四株單克隆抗體與雞ＩｇＧ的反應(yīng)性較好，結(jié)合雞ＩｇＧ的重鏈。??ｋＤ?Ｍ?１?２?３?４??ｉ?ｐｎ??５０?％■?．?．?Ｐ，??３５??２５??２０?？，場(chǎng)??圖１．２血清ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖??Ｆｉｇ?１．２?Ｔｈｅ?ＳＤＳ?ｐａｇｅ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｓｅｒｕｍ??Ｍ：?Ｍａｋｅｒ，Ｎ４：雞、鴨、鵝、兔血清??Ｍ：?Ｍａｋｅｒ?１－４：?ｃｈｉｃｋｅｎ、ｄｕｃｋ、ｇｅｅｓｅ、ｒａｂｂｉｔ?ｓｅｒｕｍ??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2857107