本研究利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)和體細胞核移植技術制備了EDAR基因打靶絨山羊動物模型,觀察到了EDAR基因打靶絨山羊頭頂沒有毛發(fā)、皮膚毛囊異常等特征,并且采用第二代高通量測序技術結合生物信息學的方法對EDAR基因打靶絨山羊皮膚差異表達基因進行分析。研究結果為今后進一步探究EDAR基因在絨山羊皮膚毛囊生長發(fā)育中的調控作用奠定了基礎。一、阿爾巴斯絨山羊EDAR基因打靶sgRNA的制備根據絨山羊EDAR基因的特點,本研究選擇在EDAR基因的第6號外顯子中設計了sgRNA1和sgRNA2兩個方向相反的sgRNA序列。經過檢測發(fā)現(xiàn),這兩個sgRNA均具有對EDAR基因的敲除活性。因此本研究選擇sgRNA1+sg RNA2+Cas9組合作為絨山羊EDAR基因打靶實驗時所選用的sgRNA。二、EDAR基因打靶陽性細胞的篩選通過電穿孔法將打靶質粒轉入絨山羊胎兒成纖維細胞中,比較了口吸管法、流式細胞儀分選法和稀釋法三種單克隆細胞的篩選方法,使用這些方法時細胞克隆形成率分別是18.75%、23.61%和62.86%。在可操作性方面,由于稀釋法更加簡單,因此本研究中利用稀釋法進行單克隆細胞的篩選。通過單克隆細胞的培養(yǎng),共成功獲得了89株細胞系,經過測序分析發(fā)現(xiàn)其中有62株細胞發(fā)生了突變,突變效率為69.66%。其中單等位基因突變率為37.1%,雙等位基因突變率為32.6%。經過對各細胞系的靶位序列進行比對分析,共發(fā)現(xiàn)了九種突變類型。其中編號為5069的細胞系生長狀態(tài)良好,鑒定為II型突變類型,因此選擇其作為制備EDAR基因打靶絨山羊時的核供體細胞。三、利用體細胞核移植技術制備EDAR基因打靶絨山羊在制備EDAR基因打靶絨山羊克隆胚胎時,共收集了3339枚山羊卵母細胞,通過成熟培養(yǎng)獲得了1875枚成熟的卵母細胞。在成功構建了1853枚克隆胚胎中有1557枚胚胎融合并且有1543枚胚胎被激活,最終獲得了329枚2細胞胚胎、430枚4細胞胚胎和107枚8細胞胚胎。同時也發(fā)現(xiàn)EDAR基因打靶克隆胚胎的融合率顯著高于野生型的克隆胚胎,但在其他階段并沒有觀察到顯著差異。本研究共完成了79例受體羊的胚胎移植手術。手術后經過探查發(fā)現(xiàn)有5只受體羊妊娠,妊娠率為6.3%。經過5個月的妊娠共有6只羔羊出生,均為雄性,其中2只出生時即為死胎,2只出生后分別存活20小時和24小時后死亡。另外2只生長狀態(tài)良好。所有EDAR基因敲除絨山羊均未檢測到EDAR蛋白的表達,且均具有頭頂沒有毛發(fā)、皮膚干燥的外表特征。通過對其皮膚組織切片進行分析發(fā)現(xiàn):EDAR基因打靶絨山羊的頭部皮膚組織中沒有任何毛囊結構,在背部和體側均發(fā)現(xiàn)了不同直徑的毛囊散布在皮膚中,并且它的毛囊排列并不像野生型那樣具有典型的三毛型毛囊結構。同時,通過測量各部位皮膚樣本切片中毛囊的直徑發(fā)現(xiàn):野生型絨山羊皮膚樣本中以直徑為30μm的毛囊為主要組成部分,而EDAR基因打靶絨山羊皮膚樣本中的毛囊以直徑為20μm的毛囊為主要組成部分。并且直徑大于50μm的毛囊在EDAR基因打靶絨山羊皮膚樣本中比野生型更多。同時也檢測了關于sgRNA1和sgRNA2靶位預測的43個潛在的脫靶位點,并沒有發(fā)現(xiàn)任何的脫靶突變事件。四、EDAR基因打靶絨山羊與野生型絨山羊皮膚基因差異表達分析對野生型和EDAR基因打靶絨山羊皮膚樣本進行高通量測序,共獲得了285,039,622條Raw Reads。經過數(shù)據過濾,獲得了277,261,506條Clean Reads。過濾后,樣本總序列中,質量值大于30(錯誤率小于0.1%)的堿基數(shù)的比例均為90%以上。將EDAR基因打靶絨山羊與野生型絨山羊各部位皮膚樣本的基因表達進行比較,獲得了各組的差異表達基因。在頭部皮膚EDAR01與WT01樣本比較中共有4899個差異基因,其中有2441個差異基因上調表達,有2458個差異基因下調表達。在背部皮膚EDAR02與WT02樣本比較中共有2151個差異基因,其中有1302個差異基因上調表達,有849個差異基因下調表達。在體側皮膚EDAR03與WT03樣本比較中共有2094個差異基因,其中有1117個差異基因上調表達,有977個差異基因下調表達。在EDAR基因打靶和野生型絨山羊各皮膚樣本中共有732個差異表達基因,其中有395個差異基因上調表達,有337個差異基因下調表達。比較得到的所有表達差異基因進行GO功能分析,在生物過程這個類別中,細胞過程、單組織過程和生物調控三個模塊的差異表達基因數(shù)量最多。在細胞組分這個類別中,細胞部分、細胞器和膜部分三個模塊的差異表達基因數(shù)量最多。在分子功能這個類別中,結合、催化和轉運三個模塊的差異表達基因數(shù)量最多。對KEGG中每個信號通路應用超幾何檢驗進行富集分析,神經活性配體-受體相互作用、視黃醇代謝和藥物代謝-細胞色素P450信號通路在各組樣本中均差異表達基因顯著性富集。
【學位單位】：內蒙古大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S827
【部分圖文】：

有機串聯(lián)起來鋅指核酸酶識別。其中，鋅指核酸酶的-1、+3、+6位殘基對靶序列的特異性識別至關重要。圖1.1 鋅指核酸酶的模式圖[30]Figure 1.1 Diagram of zinc-finger nucleases目前的實驗研究中，模塊組裝法與寡聚體庫工程法是研究人員常常制備鋅指核酶結構域的手段。模塊組裝法是將每個可以識別和結合三聯(lián)堿基的鋅指根據靶基因序列的特點一一串聯(lián)起來，就像是把不同的模塊組合在一起一樣，這樣的優(yōu)點在于操作簡便，但是由于其沒有顧忌到其對上下游序列的影響，因此也具有一定的弊端，例如較大的脫靶效率和組裝效率差同時也導致了較大的細胞毒性。而寡聚體庫工程法則是利用鋅指資源庫，由于每個鋅指對應的三聯(lián)堿基不同，因此不同的氨基酸序列產生了多個鋅指結構域，這樣就把不同的鋅指庫連接在起來形成了不同的鋅指組合，選擇親和性好的鋅指組合便有助于下游基因的表達，尤其是藥物篩選標記基因

部的磁場調整磁珠的位置，通過體處理自動化的處理得到目的TALEN重復序列，這樣的方法效率非常高。圖1.2 轉錄激活樣效應蛋白質核酸酶的模式圖[33]Figure 1.2 Diagram of transcript activator-like effector nucleases1.5 RNA 介導的 DNA 編輯（CRISPR-Cas9）CRISPR是是一小段規(guī)律成簇的間隔短回文重復序列，長約24-47bp，包括同向的重復序列和非重復間區(qū)序列。Cas是一種核酸內切酶，它與CRISPR序列相關。

利用 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)與體細胞核移植技術制備 EDAR 基因打靶絨山羊的研究一段長度為20個核苷酸的單向導RNA可以與靶序列結合，這樣CRISPR-一起構成了RNA引導性的核酸酶系統(tǒng)[34,35]。在相同物種中，CRISPR位重復序列是比較保守的，但是它的部分間區(qū)序列與噬菌體等生物的外源NA具有比較高的同源性，因此這些同源部分被稱為前間區(qū)序列。
【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 高弢;史建榮;;基于高通量測序技術分析麝香草酚處理禾谷鐮孢菌后轉錄組學的變化[J];江蘇農業(yè)學報;2017年06期

2 李莉;畢延震;華再東;任紅艷;肖紅衛(wèi);劉西梅;鄭新民;;基因編輯技術及其在畜牧業(yè)中的應用研究進展[J];基因組學與應用生物學;2016年12期

3 郭曉強;;基因編輯的發(fā)展歷程[J];科學;2016年05期

4 魏景亮;吳添文;阮進學;牟玉蓮;;基因組編輯技術改良家畜的研究進展[J];中國農業(yè)科技導報;2014年01期

5 李奇;安海龍;;ZFN/TALEN技術與作物遺傳改良[J];植物生理學報;2013年07期

6 潘曉燕;于永生;劉曉輝;王正朝;王曉陽;樸慶林;張立春;金海國;;轉K2.9基因絨山羊體細胞核移植技術體系的優(yōu)化研究[J];中國農業(yè)科學;2012年10期

7 潘玲珍;閆智勇;左長英;陳沖;李少華;;長期使用地西泮對神經活性配體受體相互作用信號通路的影響[J];中國藥科大學學報;2011年05期

8 李金泉;;我國絨山羊遺傳資源的保護與改良[J];中國畜牧業(yè);2011年18期

9 肖安;胡瑩瑩;王唯曄;楊志芃;王展翔;黃鵬;佟向軍;張博;林碩;;人工鋅指核酸酶介導的基因組定點修飾技術[J];遺傳;2011年07期

10 姚玉園;劉海英;袁纓;叢玉艷;;IGF-1和EGF對遼寧絨山羊初級毛囊體外培養(yǎng)的影響[J];沈陽農業(yè)大學學報;2010年02期

相關碩士學位論文 前1條

1 朱小蕾;稻瘟病菌一個新抗藥性標記基因的應用研究[D];安徽農業(yè)大學;2016年

本文編號：2856046