發(fā)布時間：2020-10-25 22:25

　　 本研究利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)和體細(xì)胞核移植技術(shù)制備了EDAR基因打靶絨山羊動物模型,觀察到了EDAR基因打靶絨山羊頭頂沒有毛發(fā)、皮膚毛囊異常等特征,并且采用第二代高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)的方法對EDAR基因打靶絨山羊皮膚差異表達(dá)基因進行分析。研究結(jié)果為今后進一步探究EDAR基因在絨山羊皮膚毛囊生長發(fā)育中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。一、阿爾巴斯絨山羊EDAR基因打靶sgRNA的制備根據(jù)絨山羊EDAR基因的特點,本研究選擇在EDAR基因的第6號外顯子中設(shè)計了sgRNA1和sgRNA2兩個方向相反的sgRNA序列。經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn),這兩個sgRNA均具有對EDAR基因的敲除活性。因此本研究選擇sgRNA1+sg RNA2+Cas9組合作為絨山羊EDAR基因打靶實驗時所選用的sgRNA。二、EDAR基因打靶陽性細(xì)胞的篩選通過電穿孔法將打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)入絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中,比較了口吸管法、流式細(xì)胞儀分選法和稀釋法三種單克隆細(xì)胞的篩選方法,使用這些方法時細(xì)胞克隆形成率分別是18.75%、23.61%和62.86%。在可操作性方面,由于稀釋法更加簡單,因此本研究中利用稀釋法進行單克隆細(xì)胞的篩選。通過單克隆細(xì)胞的培養(yǎng),共成功獲得了89株細(xì)胞系,經(jīng)過測序分析發(fā)現(xiàn)其中有62株細(xì)胞發(fā)生了突變,突變效率為69.66%。其中單等位基因突變率為37.1%,雙等位基因突變率為32.6%。經(jīng)過對各細(xì)胞系的靶位序列進行比對分析,共發(fā)現(xiàn)了九種突變類型。其中編號為5069的細(xì)胞系生長狀態(tài)良好,鑒定為II型突變類型,因此選擇其作為制備EDAR基因打靶絨山羊時的核供體細(xì)胞。三、利用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備EDAR基因打靶絨山羊在制備EDAR基因打靶絨山羊克隆胚胎時,共收集了3339枚山羊卵母細(xì)胞,通過成熟培養(yǎng)獲得了1875枚成熟的卵母細(xì)胞。在成功構(gòu)建了1853枚克隆胚胎中有1557枚胚胎融合并且有1543枚胚胎被激活,最終獲得了329枚2細(xì)胞胚胎、430枚4細(xì)胞胚胎和107枚8細(xì)胞胚胎。同時也發(fā)現(xiàn)EDAR基因打靶克隆胚胎的融合率顯著高于野生型的克隆胚胎,但在其他階段并沒有觀察到顯著差異。本研究共完成了79例受體羊的胚胎移植手術(shù)。手術(shù)后經(jīng)過探查發(fā)現(xiàn)有5只受體羊妊娠,妊娠率為6.3%。經(jīng)過5個月的妊娠共有6只羔羊出生,均為雄性,其中2只出生時即為死胎,2只出生后分別存活20小時和24小時后死亡。另外2只生長狀態(tài)良好。所有EDAR基因敲除絨山羊均未檢測到EDAR蛋白的表達(dá),且均具有頭頂沒有毛發(fā)、皮膚干燥的外表特征。通過對其皮膚組織切片進行分析發(fā)現(xiàn):EDAR基因打靶絨山羊的頭部皮膚組織中沒有任何毛囊結(jié)構(gòu),在背部和體側(cè)均發(fā)現(xiàn)了不同直徑的毛囊散布在皮膚中,并且它的毛囊排列并不像野生型那樣具有典型的三毛型毛囊結(jié)構(gòu)。同時,通過測量各部位皮膚樣本切片中毛囊的直徑發(fā)現(xiàn):野生型絨山羊皮膚樣本中以直徑為30μm的毛囊為主要組成部分,而EDAR基因打靶絨山羊皮膚樣本中的毛囊以直徑為20μm的毛囊為主要組成部分。并且直徑大于50μm的毛囊在EDAR基因打靶絨山羊皮膚樣本中比野生型更多。同時也檢測了關(guān)于sgRNA1和sgRNA2靶位預(yù)測的43個潛在的脫靶位點,并沒有發(fā)現(xiàn)任何的脫靶突變事件。四、EDAR基因打靶絨山羊與野生型絨山羊皮膚基因差異表達(dá)分析對野生型和EDAR基因打靶絨山羊皮膚樣本進行高通量測序,共獲得了285,039,622條Raw Reads。經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾,獲得了277,261,506條Clean Reads。過濾后,樣本總序列中,質(zhì)量值大于30(錯誤率小于0.1%)的堿基數(shù)的比例均為90%以上。將EDAR基因打靶絨山羊與野生型絨山羊各部位皮膚樣本的基因表達(dá)進行比較,獲得了各組的差異表達(dá)基因。在頭部皮膚EDAR01與WT01樣本比較中共有4899個差異基因,其中有2441個差異基因上調(diào)表達(dá),有2458個差異基因下調(diào)表達(dá)。在背部皮膚EDAR02與WT02樣本比較中共有2151個差異基因,其中有1302個差異基因上調(diào)表達(dá),有849個差異基因下調(diào)表達(dá)。在體側(cè)皮膚EDAR03與WT03樣本比較中共有2094個差異基因,其中有1117個差異基因上調(diào)表達(dá),有977個差異基因下調(diào)表達(dá)。在EDAR基因打靶和野生型絨山羊各皮膚樣本中共有732個差異表達(dá)基因,其中有395個差異基因上調(diào)表達(dá),有337個差異基因下調(diào)表達(dá)。比較得到的所有表達(dá)差異基因進行GO功能分析,在生物過程這個類別中,細(xì)胞過程、單組織過程和生物調(diào)控三個模塊的差異表達(dá)基因數(shù)量最多。在細(xì)胞組分這個類別中,細(xì)胞部分、細(xì)胞器和膜部分三個模塊的差異表達(dá)基因數(shù)量最多。在分子功能這個類別中,結(jié)合、催化和轉(zhuǎn)運三個模塊的差異表達(dá)基因數(shù)量最多。對KEGG中每個信號通路應(yīng)用超幾何檢驗進行富集分析,神經(jīng)活性配體-受體相互作用、視黃醇代謝和藥物代謝-細(xì)胞色素P450信號通路在各組樣本中均差異表達(dá)基因顯著性富集。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S827
【部分圖文】：

有機串聯(lián)起來鋅指核酸酶識別。其中，鋅指核酸酶的-1、+3、+6位殘基對靶序列的特異性識別至關(guān)重要。圖1.1 鋅指核酸酶的模式圖[30]Figure 1.1 Diagram of zinc-finger nucleases目前的實驗研究中，模塊組裝法與寡聚體庫工程法是研究人員常常制備鋅指核酶結(jié)構(gòu)域的手段。模塊組裝法是將每個可以識別和結(jié)合三聯(lián)堿基的鋅指根據(jù)靶基因序列的特點一一串聯(lián)起來，就像是把不同的模塊組合在一起一樣，這樣的優(yōu)點在于操作簡便，但是由于其沒有顧忌到其對上下游序列的影響，因此也具有一定的弊端，例如較大的脫靶效率和組裝效率差同時也導(dǎo)致了較大的細(xì)胞毒性。而寡聚體庫工程法則是利用鋅指資源庫，由于每個鋅指對應(yīng)的三聯(lián)堿基不同，因此不同的氨基酸序列產(chǎn)生了多個鋅指結(jié)構(gòu)域，這樣就把不同的鋅指庫連接在起來形成了不同的鋅指組合，選擇親和性好的鋅指組合便有助于下游基因的表達(dá)，尤其是藥物篩選標(biāo)記基因

部的磁場調(diào)整磁珠的位置，通過體處理自動化的處理得到目的TALEN重復(fù)序列，這樣的方法效率非常高。圖1.2 轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)蛋白質(zhì)核酸酶的模式圖[33]Figure 1.2 Diagram of transcript activator-like effector nucleases1.5 RNA 介導(dǎo)的 DNA 編輯（CRISPR-Cas9）CRISPR是是一小段規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列，長約24-47bp，包括同向的重復(fù)序列和非重復(fù)間區(qū)序列。Cas是一種核酸內(nèi)切酶，它與CRISPR序列相關(guān)。

利用 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)與體細(xì)胞核移植技術(shù)制備 EDAR 基因打靶絨山羊的研究一段長度為20個核苷酸的單向?qū)NA可以與靶序列結(jié)合，這樣CRISPR-一起構(gòu)成了RNA引導(dǎo)性的核酸酶系統(tǒng)[34,35]。在相同物種中，CRISPR位重復(fù)序列是比較保守的，但是它的部分間區(qū)序列與噬菌體等生物的外源NA具有比較高的同源性，因此這些同源部分被稱為前間區(qū)序列。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2856046