馬屬于單胃動(dòng)物,后腸系統(tǒng)較為發(fā)達(dá),是食物消化吸收的主要場(chǎng)所。腸道微生物對(duì)馬消化纖維素起到重要作用。蒙古馬以放牧為主,長期生活在草原上,形成了較強(qiáng)的適應(yīng)性、耐粗飼等優(yōu)良特性,為了提高蒙古馬對(duì)于飼草料的利用率,本研究以蒙古馬盲腸內(nèi)容物為實(shí)驗(yàn)材料,旨在篩選出降解能力較強(qiáng)的纖維素分解菌株,對(duì)其進(jìn)行鑒定,克隆并表達(dá)出具有纖維素酶活性的外源性蛋白,為馬源纖維分解菌和纖維素酶的工業(yè)生產(chǎn)和利用奠定理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:(1)本研究采用羧甲基纖維素鈉平板法(CMC-Na)和搖瓶發(fā)酵法進(jìn)行培養(yǎng)和分離,篩選出一株具有較高纖維素分解能力的菌株,經(jīng)革蘭氏染色、生理生化特性鑒定和16S rDNA分子學(xué)方法鑒定為Bacillus amyloliquefaciens H3(解淀粉芽孢桿菌H3)。(2)研究發(fā)現(xiàn)Bacillus amyloliquefaciens H3生長速度快,在接種后8-32h進(jìn)入對(duì)數(shù)期,32-52h為穩(wěn)定期,52h后繁殖速度逐漸進(jìn)入衰退期。該菌株所產(chǎn)生的纖維素酶最適的反應(yīng)條件為pH4.8、65℃、反應(yīng)5min,且具有較強(qiáng)的酸堿性。此外,Bacillus amyloliquefaciens H3發(fā)酵所需的最佳碳源為1%玉米粉,最佳氮源為2%的蛋白胨+酵母粉復(fù)合物(1:1),pH4.8的培養(yǎng)基,接種量4%,發(fā)酵至18-42h產(chǎn)酶量最高且保持一定程度的穩(wěn)定性。(3)從蒙古馬源Bacillus amyloliquefaciens H3中克隆到了纖維素酶基因(endo-beta-1,4-glucanase(egl),GenBank:KT800419.1),該基因長度為1500bp,編碼499個(gè)氨基酸,屬于纖維素酶中的BglC家族,其組成包括糖苷水解酶家族5(Glycoside hydrolases family 5)中的一個(gè)纖維素酶和CBM-3區(qū)域。(4)本研究成功構(gòu)建出具有降解纖維素能力的乳酸工程菌,其酶活力為0.91U/mL,高于原先菌株(0.60U/mL)。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S821;Q93
【文章目錄】：
摘要
abstract
1 前言
    1.1 馬匹胃腸道結(jié)構(gòu)及消化特點(diǎn)
        1.1.1 馬匹胃腸道結(jié)構(gòu)
        1.1.2 馬匹消化吸收特點(diǎn)
    1.2 馬匹胃腸道微生物的研究進(jìn)展
    1.3 纖維素分解菌及纖維素酶的研究進(jìn)展
        1.3.1 纖維素分解菌的純培養(yǎng)篩選
        1.3.2 纖維素的結(jié)構(gòu)和作用原理
        1.3.3 纖維素酶在飼料原料中的應(yīng)用
        1.3.4 纖維素酶基因工程菌的構(gòu)建
2 本研究的目的與意義
3 本研究的技術(shù)路線
4 實(shí)驗(yàn)一纖維素分解菌的分離鑒定及特性研究
    4.1 材料和方法
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.1.3 纖維素分解菌的分離、篩選
        4.1.4 纖維素酶活力測(cè)定
        4.1.5 菌株的種屬鑒定
        4.1.6 生長特性的研究
        4.1.7 酶學(xué)特性的研究
        4.1.8 纖維素分解菌在不同發(fā)酵條件下的產(chǎn)酶特性
        4.1.9 數(shù)據(jù)分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
        4.2.2 纖維素分解菌的分離和篩選
        4.2.3 纖維素分解菌的鑒定
        4.2.4 Bacillus amyloliquefaciens H3生長特性
        4.2.5 Bacillus amyloliquefaciens H3分泌纖維素酶的酶學(xué)特性
        4.2.6 發(fā)酵條件對(duì)Bacillus amyloliquefaciens H3產(chǎn)生纖維素酶的影響
    4.3 討論
        4.3.1 纖維素分解菌的分離和鑒定
        4.3.2 Bacillus amyloliquefaciens H3的生長趨勢(shì)
        4.3.3 纖維素酶的酶學(xué)特點(diǎn)
    4.4 小結(jié)
5 實(shí)驗(yàn)二蒙古馬源Bacillus amyloliquefaciens H3纖維素酶基因的克隆與表達(dá)
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.1.3 纖維素酶基因的克隆
        5.1.4 纖維素酶基因表達(dá)載體構(gòu)建
        5.1.5 纖維素酶基因乳酸工程菌的構(gòu)建
    5.2 結(jié)果分析
        5.2.1 纖維素酶基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果
        5.2.2 重組質(zhì)粒pMD19-BP的PCR鑒定
        5.2.3 纖維素酶蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        5.2.4 纖維素酶基因表達(dá)載體構(gòu)建
        5.2.5 纖維素酶基因乳酸工程菌的構(gòu)建
    5.3 討論
        5.3.1 纖維素酶基因的克隆
        5.3.2 纖維素酶基因乳酸工程菌的構(gòu)建
    5.4 小結(jié)
6 結(jié)論
7 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
作者簡介

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2853833