重組水泡性口炎病毒(recombinant vesicular stomatitis virus,rVSV)因其可以高效的表達(dá)外源蛋白、在病毒感染時(shí)為宿主提供有效的保護(hù)以及可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于疫苗和腫瘤治療研究。但是VSV在小鼠中具有神經(jīng)毒性,且當(dāng)VSV直接注射到牛和馬的腦中時(shí),會(huì)引起一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病。因此,野生型的VSV在使用上存在一定的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。因此,我們急需對VSV載體疫苗進(jìn)行改造,以期得到對宿主無致病性或致病性較低的rVSV。VSV的基質(zhì)蛋白M是一種多功能蛋白,在病毒感染過程中參與宿主轉(zhuǎn)錄、核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯。野生型VSV的M蛋白可以通過抑制宿主I型干擾素(IFN-α、IFN-β)的表達(dá)而抑制宿主的先天性免疫應(yīng)答,因此,M蛋白與VSV的致病性密切相關(guān)。研究表明,M蛋白的第51位甲硫氨酸突變?yōu)榫彼?VSV_(M51R))或發(fā)生缺失(VSV_(?M51))的重組VSV,抑制宿主基因表達(dá)的能力降低且致病性減弱。此外,Hoffmann等研究也表明,M蛋白的第221、226位氨基酸位點(diǎn)是兩個(gè)有潛在致弱功能的氨基酸位點(diǎn),然而這兩個(gè)位點(diǎn)在VSV致病性形成上的確切意義,尤其在動(dòng)物體內(nèi)還未有詳細(xì)的探討和研究。為此,本文針對該病毒基質(zhì)蛋白M的第221、226位氨基酸進(jìn)行了定點(diǎn)突變,制備了新型重組VSV。突變位點(diǎn)是第221位纈氨酸(V)突變?yōu)楸奖彼?F),第226位絲氨酸(S)突變?yōu)榫彼?R)。利用體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)對新型重組病毒的致病性進(jìn)行了研究。其中體外實(shí)驗(yàn)有:(1)在PC3和PEF細(xì)胞中進(jìn)行的多步生長曲線測定;(2)不同病毒誘導(dǎo)細(xì)胞I型干擾素表達(dá);(3)不同M蛋白突變株感染對宿主細(xì)胞基因表達(dá)抑制效率研究。體內(nèi)試驗(yàn)中,我們選用BABL/c小鼠來評估不同重組VSV的致病性,主要衡量指標(biāo)包括接種病毒后,小鼠體重變化、致死率以及小鼠肺和腦組織中病毒載量的測定。體外試驗(yàn)結(jié)果表明,相比野生型VSV以及221、226單位點(diǎn)突變VSV,221、226雙位點(diǎn)突變重組VSV病毒(VSV_(M221,226))的增殖能力顯著降低,其致弱效應(yīng)可能是由于病毒感染有效激活宿主細(xì)胞產(chǎn)生I型干擾素所致。在小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中,VSV_(M221,226)較野生型VSV以及221、226單位點(diǎn)突變VSV致病力明顯下降。VSV_(M221,226)有希望成為一個(gè)安全、有效的疫苗載體。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65;Q78
【部分圖文】：

上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文VM221、VSVM226、VSVM221,226質(zhì)粒的構(gòu)建利用基因克隆的方法構(gòu)建了基質(zhì)蛋白氨基酸位點(diǎn)突變的 pVSV（21、pVSVM226和 pVSVM221,226），接著通過反向遺傳技術(shù)獲得對應(yīng)的SVM221、VSVM226和 VSVM221,226）。其中，M221 是指基質(zhì)蛋白第 221）突變?yōu)楸奖彼幔‵），M226 是指基質(zhì)蛋白第 226 位絲氨酸（S）（R），而 M221,226 是指這兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生突變。如圖 2-1 所示

(b)圖 2-2 重疊 PCR 的結(jié)果Fig.2-2 The results of overlapping PCR第一輪 PCR M. DNA Marker；1.引物 P1 和 P2 的 PCR 產(chǎn)物P3 和 P8 的 PCR 產(chǎn)物（F2）第二輪 PCR M. DNA Marker；1. 引物 P1 和 P8 的 PCR 產(chǎn)物因片段）；f overlapping PCR. M. DNA Marker； 1. PCR products of p(F1)；2. PCR products of primers P3 and P8 (F2)；d of overlapping PCR. M. DNA Marker； 1. PCR products oP8 (Mutated M gene fragments)；鑒定特征譜帶顯現(xiàn)為四條不同大小的蛋白條帶，分別為一個(gè)糖基化蛋白，其目的條帶約為 60 kDa，N 與 P為一條條帶，其蛋白的分子量大小約 47 kDa，M 蛋染 VSVXN2、VSVM221、VSVM226及 VSVM221,226的 IB后制備的樣品進(jìn)行 Western blot 鑒定，其中一抗為

圖 3-1 PC3 細(xì)胞中多步生長曲線Fig.3-1 Multi-step growth curve of recombinant VSVs in PC3 cellsVSVXN2、VSVM221、VSVM226及 VSVM221,226在 PEF 中的多不生長曲線如圖，野生型 VSV 可以在 PEF 細(xì)胞中有效的復(fù)制。在感染的 12~24h 內(nèi)，VSV的細(xì)胞上清的滴度從 1.6±0.3×103pfu/mL 上升至 3.6±0.5×105pfu/mL，VSVM現(xiàn)較為一致的上升趨勢，從 1.6±0.3×103pfu/mL 上升至 2.3±0.1×105pfu/mVM221從 8.9±0.2×102pfu/mL 上升至 3.6±0.4×104pfu/mL，然而，VSVM221,226胞后，細(xì)胞上清中病毒滴度一直保持平穩(wěn)，即 VSVM221,226在 PEF 細(xì)胞中不
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本文編號(hào)：2853754