水牛分布于我國南方,具有耐粗飼、抗逆性強、奶質優(yōu)良、役力大以及使用年限長等生物學特性。隨著城市化進程以及機械化程度不斷提高,我國水牛的用途逐漸以役用為主向乳肉兼用型發(fā)展。尤其是營養(yǎng)豐富的水牛奶及其乳制品深受消費者的喜愛,使得水牛奶業(yè)具有廣闊的市場前景。至今,我國雜交水牛的單產(chǎn)水平已達到1500~1700 kg,但仍低于河流型水牛品種的單產(chǎn)水平(2000~2200 kg)。顯然,較低的產(chǎn)奶量已嚴重阻礙了當前水牛奶業(yè)的發(fā)展。因此,鑒定與水牛產(chǎn)奶性狀相關的致因基因對于提高該物種的單產(chǎn)水平至關重要。隨著高通量測序技術的迅猛發(fā)展,多組學整合分析策略已成畜禽重要經(jīng)濟性狀遺傳解析的重要手段。本研究擬從基因型數(shù)據(jù)評估、基因型和轉錄組數(shù)據(jù)的整合分析以及候選基因的家族分析與功能驗證等角度多層次挖掘和鑒定與水牛產(chǎn)奶性狀相關的候選基因,為開展奶水牛分子育種實踐奠定基礎。本研究共包括四部分內容:試驗1:取411頭純種地中海水牛和45頭中國雜交水牛基因組數(shù)據(jù),探究連鎖不平衡模式和評估有效群體大小發(fā)現(xiàn):(1)純種和雜交水牛群體中常染色體鄰近SNP的平均r~2值分別為0.13±0.19和0.09±0.13,且標記距離在200 kb時顯示出最快的LD衰減速率。(2)LD系數(shù)為0.2時,純種和雜交水牛群體的衰減距離分別為170 kb和50 kb;LD系數(shù)為0.3時的衰減距離則分別為60 kb和10 kb。這兩個群體的Phase連續(xù)性在標記距離小于100 kb時達到最大值(R_(P,C)=0.47),表明這兩個群體間的Phase相關性不是很強。(3)純種和雜交水牛群體中有效群體大小呈下降模式,在前13世代的評估值分別為387和113頭。這些研究結果為進一步開展水牛全基因組關聯(lián)分析和基因組選擇研究提供了理論依據(jù)。試驗2:為探究不同泌乳期的水牛乳腺組織表達譜特征,鑒定與產(chǎn)奶性狀相關的候選基因,本試驗開展了乳腺組織轉錄組測序、全基因組關聯(lián)分析和加權的基因共表達網(wǎng)絡分析(WGCNA)等研究發(fā)現(xiàn):(1)基于轉錄組數(shù)據(jù),共鑒定出1420個差異表達的mRNA;(2)基于基因水平的全基因組關聯(lián)分析,976個基因被納入到NSGG數(shù)據(jù)集,篩選出9個與產(chǎn)奶量相關的候選基因(P10~(-4));(3)用WGCNA分析,分別從DEGs和NSGG數(shù)據(jù)集中鑒定出與產(chǎn)奶量相關的天藍色模塊基因544和225個。最后,篩選出12個與產(chǎn)奶量相關的基因(BNIPL,TUBA1C,C2CD4B,DCP1B,MAP3K5,PDCD11,SRGAP1,GDPD5,BARX2,SCARA3,CTU2和RPL27A)作為樞紐基因。這些研究結果為深入了解水牛乳腺組織轉錄組特征和乳腺發(fā)育的生物學功能具有理論指導意義。試驗3:基于微管蛋白是微管的主要成分、在許多細胞過程中起著至關重要的作用,本試驗從全基因組水平探究了水牛微管蛋白家族及其表達規(guī)律發(fā)現(xiàn):(1)共鑒定出33個水牛微管蛋白序列,根據(jù)其結構和系統(tǒng)發(fā)育特征,可分成五個亞族;(2)同一亞族的微管蛋白序列具有相似的基因結構以及保守的基序組成;(3)水牛微管蛋白家族成員隨機分布于10條染色體上,其擴張主要與串聯(lián)重復事件有關;(4)基于轉錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn),微管蛋白在各種組織中具有不同的表達模式。多數(shù)微管蛋白基因在泌乳早期高度表達,可能與乳腺上皮細胞的凋亡有關。這些結果將為進一步驗證微管蛋白的功能,鑒定與水牛產(chǎn)奶相關候選基因奠定了理論依據(jù)。試驗4:基于以上候選基因的篩選結果,本試驗用RNA干擾和過表達技術在水牛乳腺上皮細胞(BBMEC)對TUBA1C基因進行功能驗證發(fā)現(xiàn),沉默TUBA1C基因可顯著影響B(tài)BMEC的生長,降低細胞活力,導致凋亡增加,但過表達TUBA1C則對BBMEC的生長影響不顯著。此外,干擾或過表達可分別引起11個乳脂代謝和3個乳蛋白代謝通路中相關基因的表達,從而影響B(tài)BMEC中甘油三脂的合成和β/κ酪蛋白的分泌。綜上,基于系統(tǒng)生物學原理,利用多組學數(shù)據(jù)和功能驗證鑒定水牛產(chǎn)奶性狀相關的候選基因,初步闡明了其作用機制,提高了篩選基因的可靠性,為制定水牛分子育種方案、促進其遺傳改良提供了有效的分子佐證。
【學位單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S823.83
【部分圖文】：

可靠和有效，這對今后開展奶水牛分子育種研究具有重要的科學指導意義。本研究的主要技術路線如圖 1-1 所示。圖1-1 本研究的主要步驟及生息分析技術路線Figure 1-1 Pipeline of main step and bioinformatics analysis in this study

圖 2-1 基于主成分分析的純種和雜交水牛質控前（A）后（B）個體分布圖。Figure 2-1 Individual distribution before (A) and after (B) quality control in purebred andcrossbred buffalo population using principal component analysis.2.2.3 最小等位基因頻率和單倍型模塊構建先用PLINK 1.90版本評估純種和雜交水牛群體中每一個SNP的MAF值，分析命令為：plink --bfile inputfile --freq --out outfile。再用自定義的R語言腳本對分析結果進行可視化。單倍型模塊的結構可以探究群體中典型的連鎖不平衡模式，并對遺傳學研究具有重要的意義 (Guryev et al 2006)�；谧畲笃谕惴ǎ‥xpectation Maximization,EM），采用PLINK 1.90版本的默認參數(shù)對群體進行單倍型分析，其分析命令為：plink--bfile inputfile --blocks no-pheno-req --out outfile。2.2.4 連鎖不平衡分析采用了成對的r2值檢測連鎖不平衡模式 (Hill and Robertson 1968)，并計算每一條

交和純種水牛群體的平均物理距離分別為44.96 kb和44.94 kb。純種水牛群體中所有常染色體SNP的平均MAF值為0.29 ±0.13，而雜交水牛群體的MAF值則為0.32 ±0.12,但前者擁有MAF值介于0.05 ~ 0.1的SNP比例要高于后者（圖2-2）。表 2-3 SNP 分型及質控情況Table 2-3 Number of SNPs genotyped and remained after quality control filtration.品種Breed(N)過濾的 SNPSNP eliminated濾過后的 SNPFinal SNP樣 本 大小1Samplesize檢出率Call rate（< 95%）哈迪-溫伯格平衡 HWE(P < 10-6)最小等位基因頻率 MAF(<0.05)有效的 SNP 數(shù)SNPs in used (%)純種(n=430) 1920 371 5335 55090(87.84%)55032(87.75%)411雜交(n=65) 4878 68 2738 45共有 SNP 524781代表經(jīng) PCA 分析和質控后的樣本大小。
【參考文獻】

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本文編號：2853337