發(fā)布時間：2020-10-20 07:42

　　 鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的家鴨、鵝、火雞和多種禽類的一種細菌性傳染病,臨床剖檢癥狀主要為全身漿膜的炎性滲出。本病在世界廣泛分布,感染引起高發(fā)病率和死亡率,為我國法定的二類動物疫病。RA血清型眾多且復雜,各血清型之間交叉保護性低,給該病的防治帶來諸多困難。而且本病一旦發(fā)生很難徹底清除,主要以藥物防治為主。因此加強RA的致病機制的研究,對從根本上預防該病的發(fā)生具有重要意義。鐵是細菌生長和繁殖的關鍵性元素,廣泛存在于細菌代謝途徑中。但是過量的鐵容易引起芬頓反應產(chǎn)生羥自由基進而對細胞產(chǎn)生毒害反應。鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白(ferric uptake regulator,Fur)不僅調(diào)控細菌鐵的穩(wěn)態(tài),并且能夠與其它調(diào)控系統(tǒng)協(xié)同作用,直接或間接調(diào)控細菌的生長、代謝和毒力。但是Fur在RA中的作用尚不清楚�；蛉笔羌毦肿由飳W研究的基本工具,但目前還沒有關于RA無抗性基因缺失株方法的報道。因此,本研究首先利用苯丙氨酸-t RNA合成酶phe S和lac Z,構(gòu)建了RA-YM株fur基因無抗性缺失突變株。以野生型質(zhì)粒p RA-JX為基礎,構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒p RES-JX-spc,利用該質(zhì)粒構(gòu)建回復株CΔfur。通過動物實驗驗證Fur與RA的毒力有關。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),篩選了鴨疫里氏桿菌基因組中受鐵調(diào)控基因和受Fur調(diào)控基因,對Fur調(diào)節(jié)RA的毒力機制進行研究。具體內(nèi)容如下:1.鴨疫里氏桿菌fur基因無抗性基因缺失突變株Δfur及回復株CΔfur的構(gòu)建與鑒定本文首先構(gòu)建了用于RA無抗性基因缺失突變株的自殺性質(zhì)粒p RE-lac Z-mphe S-spc和回復株的穿梭質(zhì)粒p RES-JX-spc。利用生長抑制試驗發(fā)現(xiàn)RA對0.2%對氯苯丙氨酸敏感,證實phe S可以做為負篩選標記。通過對Phe S 301位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)楦拾彼?其它進行無義突變,野生型核苷酸序列與突變型核苷酸序列同源性71%,減少在該位點發(fā)生同源重組的概率。將突變型phe S與RA的rps L基因啟動子融合構(gòu)建mphe S表達盒。克隆lac Z基因,與rps L啟動子融合,利用X-gal通過顏色可以直觀的鑒定同源重組是否完成。以p RE112質(zhì)粒為基礎,結(jié)合抗性基因spc,負篩選標記phe S和指示標記lac Z連接構(gòu)建自殺性質(zhì)粒p RE-lac Z-mphe S-spc�？寺 RA-JX質(zhì)粒的復制區(qū)域,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒p RES-JX-spc,利用該質(zhì)粒可以構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的回復突變菌株。構(gòu)建了RA-YMΔfur無抗性基因缺失突變株和回復株CΔfur�？寺ur基因的左、右同源臂,利用重疊PCR將左右同源臂融合,通過酶切的方法并連接至自殺性質(zhì)粒p RE-lac Z-mphe S-spc。以含有自殺性質(zhì)粒p RE-lac Z-mphe S-spc-fur的E.coli X7213為供體菌,以RA-YM株為受體菌,通過兩步同源重組法篩選得到RA-YMΔfur無抗性基因缺失突變株。第一步首先利用篩選標記spc篩選雜合體菌株,第二步利用篩選標記phe S和lac Z篩選無抗性基因缺失株。克隆fur基因啟動子和編碼區(qū)序列,利用重疊PCR融合fur基因啟動子和編碼區(qū),通過酶切的方法連接到穿梭質(zhì)粒p RES-JX-spc。以含有重組穿梭質(zhì)粒p RES-JX-spc-fur的E.coli X7213為供體菌,以RA-YMΔfur為受體菌,利用篩選標記spc篩選回復株CΔfur。通過感染雛鴨測定RA-YMΔfur的致病性。動物試驗結(jié)果顯示野生株RA-YM、基因缺失突變株RA-YMΔfur和回復突株CΔfur的LD50分別為2.0×106 CFU,1.6×108CFU和1.2×107 CFU。RA-YMΔfur基因缺失突變株的毒力較野生株RA-YM毒力下降約80倍,回復株CΔfur的毒力較RA-YMΔfur毒力有所回升。對野生株RA-YM和RA-YMΔfur基因缺失突變株的血液和組織載菌量進行比較,結(jié)果顯示RA-YMΔfur基因缺失突變株的載菌量均較野生株RA-YM低。另外組織剖檢和病理切片觀察,RA-YMΔfur基因缺失突變株引起的組織病變較野生株RA-YM輕微。證實fur基因與RA-YM株的毒力有關。2.轉(zhuǎn)錄因子Fur的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的研究通過對RA-YM菌株和RA-YMΔfur菌株在限鐵和富鐵情況下的轉(zhuǎn)錄組進行比較,從全基因組水平上篩選受鐵調(diào)控基因和受Fur調(diào)控基因。并隨機挑選4個受鐵調(diào)控的基因和4個受Fur調(diào)控的基因,利用熒光定量PCR對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行驗證,結(jié)果顯示熒光定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相符。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果篩選出70個受鐵調(diào)控基因和17個受Fur調(diào)控基因。轉(zhuǎn)錄組測序具體結(jié)果如下:限鐵條件下,鐵調(diào)控的基因中有45個基因表達上調(diào)。其中7個與細菌的鐵運輸和儲存有關,6個與細菌的固氮過程有關,5個與氨基酸和輔酶的合成有關,5個與細胞表面結(jié)構(gòu)與修飾有關,2個與嘌呤和核苷酸的合成有關;其余的與大分子的合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能以及未知功能等有關。限鐵條件下,鐵調(diào)控的基因中有25個基因表達下調(diào)。其中6個與三羧酸循環(huán)有關,7個與氧化應激有關,其余與細胞的轉(zhuǎn)運功能以及未知功能等有關。Fur直接調(diào)控的基因有17個,其中5個參與鐵的獲取,2個參與氧化應激,1個為IX型分泌系統(tǒng)元件,其余參與氨基酸的合成和未知功能等。另外對Fur直接調(diào)控的基因啟動子序列分析,預測得到Fur結(jié)合位點的序列為5’-ATTTAGAATTATTCTAAAT-3’。利用p ET28a-fur質(zhì)粒對Fur蛋白進行原核表達。擴增fur基因的編碼區(qū),通過酶切構(gòu)建p ET28a-fur質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化E.coil BL21(DE3)感受態(tài)細胞。利用IPTG誘導表達并利用His標簽純化柱純化Fur蛋白。隨機選擇4個受Fur調(diào)控的基因,利用生物素標記的引物擴增其啟動子序列,利用原核表達的Fur蛋白,通過凝膠遷移實驗驗證Fur蛋白與啟動子的互作,結(jié)果顯示Fur蛋白在體外可以與調(diào)控基因的啟動子序列結(jié)合。綜上所述,本試驗成功的構(gòu)建了基于苯丙氨酸-t RNA合成酶phe S和lac Z為篩選標記的無抗性基因缺失株方法,構(gòu)建了fur基因缺失株RA-YMΔfur。構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒p RES-JX-spc,利用該質(zhì)粒構(gòu)建了回復株CΔfur。通過動物實驗驗證fur基因與RA的毒力有關。并通過對RA-YM和RA-YMΔfur在限鐵和富鐵情況下的轉(zhuǎn)錄組進行比較,獲得受鐵調(diào)控基因以及Fur調(diào)控基因,預測得到RA的Fur-box序列為5’-ATTTAGAATTATTCTAAAT-3’。Fur通過調(diào)節(jié)鐵攝取系統(tǒng)和氧化還原反應以及IX型分泌系統(tǒng)等,進而調(diào)節(jié)TCA循環(huán)相關酶類的表達,芳香族氨基酸,嘌呤和核苷酸的合成,影響RA的毒力。
【學位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

r and Choudhry 2010)。但是另一方面，鐵過剩對細菌芬頓反應(Escolar et al 1999)。鐵容易將電子傳遞自由基, 對細胞膜、DNA 和蛋白質(zhì)等產(chǎn)生破壞(The必須保持在需要的限度之內(nèi)。多種機制，使自身可以獲得足夠的鐵的同時并維持多種途徑攝取鐵，一種途徑是利用鐵載體運輸鐵離微生物都能夠大量合成鐵載體�！拌F載體”最初來載體是一類具有高度專一性的鐵螯合劑，能夠高特成受環(huán)境中鐵濃度的影響(Stintzi et al 2000)。鄰苯二菌素等均可結(jié)合 Fe3+(Henderson et al 2009)。分泌溶解鐵，然后鐵載體與 Fe3+特異性結(jié)合，通過 Ton隙，并與周質(zhì)蛋白結(jié)合傳遞至 ABC 系統(tǒng)(ATP-bin胞質(zhì)中，在細胞質(zhì)中鐵載體與 Fe3+分離，F(xiàn)e3+被還原利用(K ster2001)。革蘭氏陰性菌利用鐵載體運輸鐵

圖 1-2 Fur 蛋白的負調(diào)控機制(Carpenter et al 2009)Fig. 1-2 The mechanism of iron-bound Fur repression控機制深入，發(fā)現(xiàn) Fur 蛋白不僅有負調(diào)控機制，還存在一r 的調(diào)控模式還存在爭議。但 Ernst 等發(fā)現(xiàn)在幽門、呼吸、能量代謝、趨藥性、氧自由基的清除的al 2005a)。另外幽門螺桿菌中 prf，sodB 基因也受1; Ernst et al 2005b)。近年研究發(fā)現(xiàn)空腸彎曲桿菌Holems et al 2005)。的調(diào)控機制與 Fur 的負調(diào)控機制的不同之處是：負爭結(jié)合位點，apo-Fur 調(diào)控機制是通過與轉(zhuǎn)錄抑制胞內(nèi) Fe2+不足時，apo-Fur 會與調(diào)控基因啟動子的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄抑制子的結(jié)合，從而使 RNA 聚合酶可以與調(diào)控基因順利轉(zhuǎn)錄。但當胞內(nèi) Fe2+充足時，F(xiàn)ur 蛋白與 F

圖 1-3 apo-Fur 的調(diào)控機制(Carpenter et al 2009)Fig. 1-3 The regulator mechanism of apo-Fur螺桿菌內(nèi)，F(xiàn)ur-Fe2+復合物還可以誘導一些基因 oorD 基因、固氮作用相關的 nifS 基因均推測受z et al 2006;Alamuri et al 2006)。體結(jié)合在調(diào)控基因啟動子上的核苷酸序列稱為內(nèi)發(fā)現(xiàn)，不同的細菌 Fur-box 序列并不完全相回文序列。ur-box 序列是一個大小為 19 bp 的核苷酸序列。基為軸的反向重復序列，序列為 GATAATGAT是“GATAAT”的 2-3 次重復形成的序列，F(xiàn)ur 序列從而結(jié)合到目標 DNA 上(Sebastian et al 強 Fur 的結(jié)合，這個模型可以解釋大多數(shù)的 F
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本文編號：2848409