隨著我國養(yǎng)豬業(yè)向集約化和規(guī)�；较虬l(fā)展,規(guī)�；i場疫病多發(fā)、多種病原混合感染較普遍存在,給養(yǎng)豬業(yè)造成了一定損失。其中豬偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起豬繁殖障礙的三種重要疫病病原。這三種病臨診癥狀相似,需要進(jìn)行鑒別診斷。本研究旨在進(jìn)行PRV-PPV-PCV2聯(lián)合共檢可視化基因芯片的構(gòu)建,并建立其檢測方法和進(jìn)行初步應(yīng)用評價研究,該研究成功制備PRV-PPV-PCV2聯(lián)合共檢可視化基因芯片和建立其檢測方法,該檢測方法檢測結(jié)果不需掃描儀肉眼即可見。主要研究如下：1.探針基因重組質(zhì)粒菌的構(gòu)建本試驗(yàn)成功構(gòu)建了用于制備可視化基因芯片的T/NS1和T/ORF2兩個檢測探針以及T/PUC18和T/GAPDH兩個定位探針基因重組質(zhì)粒菌。根據(jù)Genbank中收錄的基因序列,設(shè)計(jì)PPV、PCV2、PUC18和GAPDH各1對特異性引物。以PPV滅活疫苗、PCV2實(shí)驗(yàn)室分離株為材料提取其基因組DNA。以各基因組DNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增克隆獲得PPV NS1、PCV2 ORP2、PUC18和GAPDH基因,其長度大小分別為100 bp、122 bp、217 bp、257 bp將所獲得的4個基因分別與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,經(jīng)PCR擴(kuò)增和核酸序列測定成功地篩選出4個探針基因重組質(zhì)粒菌。為可視化基因芯片的構(gòu)建建立了可長期保存的探針基因,是芯片制備的核心技術(shù)之一2.可視化基因芯片的構(gòu)建與檢測技術(shù)優(yōu)化本試驗(yàn)對可視化基因芯片的制備及其檢測操作程序的優(yōu)化進(jìn)行了研究,并確定了芯片檢測質(zhì)量與結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。制備的芯片可對PRV、PPV、PCV2進(jìn)行檢測,并可對PRV的疫苗株與野毒株感染進(jìn)行區(qū)分�；蛐酒闹苽湟蕴结樆蛑亟M質(zhì)粒為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增、乙醇沉淀法純化制備探針基因。使用Baio(?)點(diǎn)樣緩沖液將其稀釋至一定濃度,經(jīng)變性處理后噴樣。噴樣完成固定一定時間即成功制備好芯片。靶基因的標(biāo)記以提取的病毒基因組DNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增對靶基因進(jìn)行生物素標(biāo)記。在PCR的擴(kuò)增標(biāo)記體系中,加入5'端標(biāo)記有生物素的上游引物,隨著PCR的擴(kuò)增對靶基因進(jìn)行標(biāo)記。芯片制備與檢測技術(shù)的優(yōu)化對探針基因噴樣濃度、重復(fù)噴樣次數(shù)、探針基因固定時間、雜交時間及底物顯色時間進(jìn)了優(yōu)化,確定了芯片檢測的操作程序?yàn)椋禾结樆驀姌訚舛葹?00ng/ul用點(diǎn)樣儀一次噴樣,放置80℃固定2h即成功制備好芯片。芯片44℃預(yù)雜交1.5 h：將靶基因95℃變性10 min后立即冰浴冷卻5 min,各取100u1進(jìn)行芯片雜交1.5 h.然后用洗液Ⅰ,洗液Ⅱ,洗液Ⅲ依次各洗滌5 min； 37℃封閉40min; 37℃酶聯(lián)30 min后按上述條件再次洗滌,加入底物顯色8 min后即完成雜交。芯片檢測質(zhì)量與結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)確定了芯片檢測質(zhì)量與結(jié)果判定的標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)陽性對照生成棕色斑點(diǎn),空白對照無斑點(diǎn)生成,以及陰性對照無斑點(diǎn)生成或斑點(diǎn)顏色較淡來判定芯片的質(zhì)量；根據(jù)靶基因與陰性對照和空白對照的斑點(diǎn)顏色對比的深淺來判定檢測結(jié)果是否為陽性。3.可視化基因芯片檢測技術(shù)的評價本試驗(yàn)對決定芯片質(zhì)量的特異性、靈敏性和保存期進(jìn)行了研究,并將其應(yīng)用于臨床樣本的檢測,同時比較其與PCR檢測結(jié)果的吻合度。特異性、靈敏性和保存期檢測對所構(gòu)建芯片的特異性、靈敏性和保存期進(jìn)行了研究。分別用PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV、JEV PCR標(biāo)記產(chǎn)物與芯片進(jìn)行雜交,以檢測其特異性；將各探針基因質(zhì)粒DNA、PCR擴(kuò)增標(biāo)記,分別作10×系列倍比稀釋后與芯片進(jìn)行雜交,以檢測其靈敏性；以PCV2檢測基因芯片為例,分別將保存30天、60天、90天和120天后的芯片各抽取一張,進(jìn)行雜交檢測,以檢測其保存期。結(jié)果表明,CSFV、PRRSV、JEV檢測結(jié)果均為陰性,PRV、PPV、PCV2各靶基因之間也無交叉反應(yīng),表明其特異性好；PRV-gB、PRV-gE、PPV-NS1和PCV2-ORF2探針基因的靈敏性分別為：18.3 pg/μl、17.4pg/μl、11.7 pg/u和13.2 pg/μl,均較PCR靈敏性高10倍；芯片在保存120天后仍可進(jìn)行有效檢測。臨床樣本檢測應(yīng)用所構(gòu)建的芯片對四川、重慶、福建、貴州、甘肅等地103份臨床樣本進(jìn)行了檢測。提取病死豬的組織基因組DNA,用PCR擴(kuò)增標(biāo)記后進(jìn)行雜交檢測,比較其與PCR檢測結(jié)果的吻合度。結(jié)果表明：PRV、PPV、PCV2的陽性率分別為22.3%(其中疫苗株為2.9%,野毒株為19.4%)、8.7%、78.6%,PRV-PPV為8.7%,PRV+PCV2為22.3%,PPV+PCV2為8.7%,PRV+PPV+PCV2為8.7%.表明臨床上這三種病的混合感染情況較為普遍。芯片與PCR的檢測總符合率均在97%以上,表明所構(gòu)建的芯片質(zhì)量可靠,可用于臨床樣本的檢測。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S852.65
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號說明
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 豬偽狂犬病概述及其診斷方法
        1.1 概述
        1.2 豬偽狂犬病診斷方法
            1.2.1 傳統(tǒng)診斷方法
            1.2.2 分子生物學(xué)診斷方法
            1.2.3 血清學(xué)診斷方法
    2 豬細(xì)小病毒病概述及其診斷方法
        2.1 概述
        2.2 豬細(xì)小病毒病診斷方法
            2.2.1 傳統(tǒng)診斷方法
            2.2.2 分子生物學(xué)診斷方法
            2.2.3 血清學(xué)診斷方法
    3 豬圓環(huán)病毒感染概述及其診斷方法
        3.1 概述
        3.2 豬圓環(huán)病毒診斷方法
            3.2.1 傳統(tǒng)診斷方法
            3.2.2 分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究進(jìn)展
            3.2.3 血清學(xué)診斷方法
    4 可視化基因芯片技術(shù)在疾病檢測中的應(yīng)用
        4.1 可視化基因芯片在病毒病檢測中的應(yīng)用
        4.2 可視化基因芯片在細(xì)菌病檢測中的應(yīng)用
    5 本研究的目的與意義
第二章 探針基因重組質(zhì)粒菌的構(gòu)建
    1 材料
        1.1 種毒
        1.2 探針基因重組質(zhì)粒菌
        1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        1.4 主要試劑
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 探針基因重組質(zhì)粒菌的制備
            2.1.1 引物設(shè)計(jì)
            2.1.2 病毒基因組的抽提
            2.1.3 探針基因的PCR鑒定
            2.1.4 探針基因的膠回收
            2.1.5 探針基因的連接
            2.1.6 探針基因的轉(zhuǎn)化
        2.2 探針基因重組質(zhì)粒菌鑒定
            2.2.1 探針基因重組質(zhì)粒菌質(zhì)粒提取
            2.2.2 探針基因重組質(zhì)粒菌的PCR鑒定
        2.3 探針基因重組質(zhì)粒序列測定和同源性分析
        2.4 探針基因重組質(zhì)粒菌的保存
    3 結(jié)果與分析
        3.1 探針及定位基因引物設(shè)計(jì)結(jié)果
        3.2 基因組DNA的PCR鑒定結(jié)果
        3.3 探針基因膠回收
        3.4 探針基因轉(zhuǎn)化結(jié)果
        3.5 探針基因重組質(zhì)粒菌PCR鑒定結(jié)果
        3.6 探針基因序列分析
            3.6.1 PPV-NS1基因序列分析
            3.6.2 PCV2-ORF2基因序列分析
            3.6.3 PUC18基因序列分析
    4 討論
        4.1 探針基因的選擇
        4.2 引物的設(shè)計(jì)
        4.3 探針基因的PCR擴(kuò)增、克隆、鑒定
        4.4 探針基因序列分析
    5 小結(jié)
第三章 PRV-PPV-PCV2可視化基因芯片的構(gòu)建與檢測技術(shù)優(yōu)化
    1 材料
        1.1 探針基因重組質(zhì)粒菌
        1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        1.3 分子雜交材料與試劑
        1.4 其他主要材料與試劑
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 探針基因的制備
            2.1.2 探針基因的PCR擴(kuò)增
            2.1.3 探針基因的純化
            2.1.4 探針基因的濃度及純度測定
        2.2 可視化基因芯片的制備
            2.2.1 陣列的設(shè)計(jì)排布
            2.2.2 噴樣
            2.2.3 探針基因固定、密封與保存
        2.3 靶基因的PCR擴(kuò)增標(biāo)記
        2.4 可視化基因芯片檢測操作程序
            2.4.1 預(yù)雜交
            2.4.2 雜交
            2.4.3 封閉
            2.4.4 酶聯(lián)
            2.4.5 顯色
        2.5 可視化基因芯片的優(yōu)化
            2.5.1 載體的選擇
            2.5.2 探針基因噴樣濃度的選擇
            2.5.3 重復(fù)噴樣次數(shù)的選擇
            2.5.4 探針基因固定時間的選擇
            2.5.5 芯片雜交時間的選擇
            2.5.6 底物顯色時間的選擇
    3 結(jié)果與分析
        3.1 探針基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.2 探針基因濃度及純度測定結(jié)果
        3.3 靶基因PCR擴(kuò)增標(biāo)記結(jié)果
        3.4 可視化基因芯片的優(yōu)化結(jié)果
            3.4.1 載體選擇結(jié)果
            3.4.2 探針基因噴樣濃度選擇結(jié)果
            3.4.3 探針基因重復(fù)噴樣次數(shù)選擇結(jié)果
            3.4.4 探針基因固定時間選擇結(jié)果
            3.4.5 芯片雜交時間選擇結(jié)果
            3.4.6 底物顯色時間選擇結(jié)果
    4 討論
        4.1 基因芯片的制備
        4.2 靶基因的標(biāo)記
        4.3 芯片背景值的控制
        4.4 視化基因芯片的檢測結(jié)果判定
    5 小結(jié)
第四章 可視化基因芯片的檢測技術(shù)評價
    1 材料
        1.1 基因芯片
        1.2 探針基因重組質(zhì)粒菌
        1.3 臨床樣本
        1.4 主要試劑與儀器設(shè)備
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 可視化基因芯片特異性檢測評價
        2.2 可視化基因芯片靈敏性檢測評價
        2.3 可視化基因芯片的保存期檢測評價
        2.4 可視化基因芯片臨床樣本檢測評價
    3 結(jié)果分析
        3.1 可視化基因芯片特異性檢測評價結(jié)果
        3.2 可視化基因芯片靈敏性檢測評價結(jié)果
            3.2.1 基因芯片靈敏性檢測結(jié)果
            3.2.2 PCR靈敏性檢測結(jié)果
        3.3 可視化基因芯片保存期檢測評價結(jié)果
        3.4 可視化基因芯片臨床樣本檢測評價結(jié)果
    4 討論
        4.1 基因芯片檢測的特異性、靈敏性與保存期
        4.2 臨床樣本檢測
    5 小結(jié)
研究結(jié)論與創(chuàng)新
    1 研究結(jié)論
    2 研究創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄

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本文編號：2846856