狂犬病(Rabies),又稱“恐水癥”,是由狂犬病病毒屬(Lyssavirus genus)的病毒感染引起的人獸共患傳染病。目前所有病例中,因該病毒屬最典型成員——狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的狂犬病病例占比最大。雖然使用疫苗并遵循合理的免疫程序能夠有效預防狂犬病,但是目前仍然缺少狂犬病發(fā)病后的有效治療方法,一旦出現(xiàn)臨床癥狀,其死亡率幾乎為100%。我國是狂犬病的高發(fā)地區(qū),死亡人數(shù)居世界第二位。因此,迫切需要加強RABV致病機制研究,以便從病毒或宿主角度尋找有效的救治靶點。細胞自噬是發(fā)生在細胞質中細胞清除異源性、內源性異物的重要生理過程。大量研究證明,許多病毒的致病機制與細胞自噬有關。例如,水皰性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)誘導的細胞自噬是一種細胞的先天性免疫應答,可抑制VSV的感染;而A型流感病毒等存在干擾自噬的分子機制,抑制自噬的發(fā)生而利于病毒的感染。截至目前,有關RABV感染和細胞自噬的研究較少。RABV標準攻擊毒株(CVS-11株)能夠引起小鼠嚴重的神經癥狀,并最終導致被感染小鼠的死亡。本實驗室前期蛋白質組學研究結果表明,RABV(CVS-11株)感染的小鼠腦組織中差異表達蛋白高度靶向細胞自噬通路,且宿主自噬相關因子Bax-interacting factor-1(Bif-1)蛋白的表達存在顯著差異。為此,本研究選取Bif-1蛋白為研究對象,采用過表達、基因沉默等分子生物學技術,對Bif-1蛋白表達與RABV(CVS-11株)復制的相互關系以及Bif-1蛋白的表達在RABV誘導的細胞自噬過程中的作用進行了初步探索。第一章:RABV感染對不同宿主細胞Bif-1蛋白表達的影響。以RABV(CVS-11株)分別感染小鼠神經瘤細胞(Mouse neuroblastoma cells,NA)和乳倉鼠腎細胞(Baby hamster kidney cells,BHK),每隔12h收取細胞總RNA及蛋白樣品,同時設立未經病毒感染的正常細胞對照組。應用實時定量PCR(RT-qPCR)、蛋白質免疫印跡(Western Blot,WB)等方法檢測樣品中Bif-1mRNA和蛋白質的表達。結果顯示,與對照組相比,NA細胞感染RABV后Bif-1mRNA水平表達量升高,而Bif-1蛋白質水平表達量早期短暫升高后又降低;BHK細胞感染RABV后Bif-1 mRNA水平及蛋白質水平表達量均降低。表明RABV感染對神經細胞和體細胞中Bif-1蛋白表達的影響存在差異。第二章:不同宿主細胞Bif-1基因沉默對RABV復制的影響。設計并篩選靶向沉默Bif-1基因的sh RNA質粒。shRNA質粒經脂質體轉染NA或BHK細胞24h后接種RABV,于感染后24h、48h收取細胞培養(yǎng)液上清及細胞總RNA樣品,同時設立表達無靶向性shRNA的細胞對照組。應用RT-qPCR、TCID_(50)測定的方法檢測細胞中病毒基因組RNA及上清中子代病毒的產量。結果顯示,與對照組相比,NA細胞Bif-1基因沉默有利于RABV復制;BHK細胞Bif-1基因沉默抑制RABV復制。表明神經細胞和體細胞中Bif-1蛋白基因沉默對RABV復制的影響是不同的。第三章:不同宿主細胞Bif-1蛋白過表達對RABV復制的影響。構建鼠源Bif-1蛋白7種選擇性剪接異構體真核表達質粒。轉染、接毒及樣品檢測方法同第二章。同時設立轉染空載體的細胞對照組。結果顯示,與對照組相比,NA細胞過表達Bif-1b、c、e亞型蛋白抑制RABV復制;BHK細胞過表達Bif-1a、b、c、e亞型蛋白均有利于RABV復制。表明神經細胞和體細胞中Bif-1蛋白不同亞型過表達對RABV復制的影響是不同的。第四章:NA細胞Bif-1蛋白過表達對RABV誘導的細胞自噬和細胞凋亡的影響。應用電鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞術、WB等方法檢測RABV感染正常NA細胞或過表達Bif-1蛋白的NA細胞后自噬體生成,自噬關鍵蛋白LC3-II、SQSTM1的表達,Bif-1與LC3細胞內定位,細胞凋亡標志蛋白Act-casp-3、Annexin V的表達。結果顯示,RABV感染誘導NA細胞發(fā)生不完整自噬并伴隨細胞凋亡;RABV感染誘導Bif-1蛋白與LC3發(fā)生共定位;過表達Bif-1蛋白促進了RABV感染后自噬底物的降解,且抵抗RABV感染誘導的細胞凋亡。綜上所述,本研究從宿主蛋白和病毒相互作用的角度分析了Bif-1蛋白表達與RABV復制之間的相互關系,并從細胞自噬以及細胞凋亡的角度對Bif-1蛋白在RABV誘導的神經細胞自噬、凋亡中的作用進行了探索,表明Bif-1c亞型具有抵抗RABV復制的作用,可能成為抗RABV藥物研發(fā)的潛在靶點。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【文章目錄】：
中文摘要
abstract
引言
第一篇 文獻綜述
    第一章 狂犬病概述
        1.1 狂犬病的歷史與現(xiàn)狀
        1.2 狂犬病病原學
        1.3 狂犬病病毒致病機制研究
        1.4 狂犬病發(fā)病后臨床處治
    第二章 Bif-1蛋白概述
        2.1 Bif-1蛋白與內吞蛋白家族
        2.2 Bif-1與細胞凋亡
        2.3 Bif-1與細胞自噬
第二篇 研究內容
    第一章 RABV感染對不同宿主細胞Bif-1蛋白表達的影響
        1.1 材料與方法
        1.2 實驗結果
        1.3 討論
        1.4 小結
    第二章 不同宿主細胞Bif-1基因沉默對RABV復制的影響
        2.1 材料與方法
        2.2 結果
        2.3 討論
        2.4 小結
    第三章 不同宿主細胞Bif-1蛋白過表達對RABV復制的影響
        3.1 材料與方法
        3.2 結果
        3.3 討論
        3.4 小結
    第四章 NA細胞Bif-1蛋白過表達對RABV誘導的細胞自噬和細胞凋亡的影響
        4.1 材料與方法
        4.2 結果
        4.3 討論
        4.4 小結
結論
參考文獻
導師簡介
作者簡介及攻讀學位期間發(fā)表的學術論文
致謝

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本文編號：2846597