豬瘟(Classical swine fever,CSF)是一種重要的豬的傳染性疾病,給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失,該病的病原體為豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)。近些年來已經(jīng)很少見急性典型病例,主要以溫和的非典型性病例為主,然而非典型病例的出現(xiàn)使豬瘟的防控形勢(shì)更加嚴(yán)峻,持續(xù)性感染是豬瘟在我國難以根除的主要原因。目前對(duì)CSF的治療無有效方法,豬瘟還繼續(xù)威脅著養(yǎng)殖業(yè),因此研究并闡明CSFV的致病機(jī)制是非常必要的。NS5B蛋白是RNA依賴的RNA酶,保守序列為GDD,負(fù)責(zé)RNA復(fù)制。NS5B蛋白具有類似于右手的手指,手掌和拇指形狀的結(jié)構(gòu)域,展示了聚合酶典型的一般折疊。已經(jīng)證明了NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白對(duì)于基因組復(fù)制是必須的。非結(jié)構(gòu)蛋白和非編碼區(qū)之間的相互作用參與調(diào)控RNA復(fù)制和翻譯。然而NS5B蛋白也很可能通過與宿主蛋白之間的相互作用來影響CSFV的復(fù)制和翻譯,目前NS5B蛋白與宿主蛋白之間相互作用參與病毒復(fù)制的機(jī)理并不明確。本研究以CSFV NS5B蛋白為誘餌,并將誘餌蛋白NS5B克隆到p GBKT7載體上,通過對(duì)誘餌蛋白自激活和毒性檢測(cè)后,將轉(zhuǎn)化有pGBKT7-NS5B的Y2H Gold酵母菌株與PAM cDNA文庫進(jìn)行雜交試驗(yàn),最終從不同營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選并得到了90個(gè)陽性克隆,對(duì)陽性克隆進(jìn)行PCR篩選鑒定,最終得到了60個(gè)陽性克隆,對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。通過將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列信息進(jìn)行Blast比對(duì)分析后,最終得到并確認(rèn)12個(gè)與CSFV NS5B蛋白相互作用的宿主蛋白。從前期篩選的宿主蛋白中選擇可能與CSFV復(fù)制和細(xì)胞自噬相關(guān)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為進(jìn)一步深入研究的宿主蛋白,酵母回返試驗(yàn)證實(shí)了CSFV NS5B蛋白可以與GAPDH蛋白相互作用。隨后我們利用GST-Pulldown和激光共聚焦均驗(yàn)證GADPH蛋白與NS5B蛋白存在相互作用。然而GAPDH參與CSFV復(fù)制和細(xì)胞自噬的相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。綜上所述,本試驗(yàn)通過酵母雙雜交技術(shù)篩選出了12個(gè)與CSFV NS5B蛋白相互作用的宿主蛋白,并且利用GST-Pulldown和激光共聚焦驗(yàn)證了GADPH蛋白能夠與NS5B蛋白相互作用。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【文章目錄】：
摘要
abstract
文獻(xiàn)綜述
    第一章 豬瘟病毒及甘油醛-3-磷酸脫氫酶研究進(jìn)展
        1.1 豬瘟病毒研究進(jìn)展
            1.1.1 豬瘟概況
            1.1.2 豬瘟病毒研究進(jìn)展
            1.1.3 NS5B蛋白研究進(jìn)展
            1.1.4 豬瘟病毒和宿主細(xì)胞相互作用的研究進(jìn)展
        1.2 GAPDH研究進(jìn)展
            1.2.1 GAPDH與細(xì)胞凋亡
            1.2.2 與GAPDH相互作用的其他蛋白質(zhì)
            1.2.3 GAPDH和端粒
            1.2.4 GAPDH和RNA
            1.2.5 GAPDH和病毒感染
            1.2.6 GAPDH的磷酸化活性
            1.2.7 GAPDH的調(diào)節(jié)
            1.2.8 GAPDH與神淀粉樣蛋白神經(jīng)退行性疾病
            1.2.9 GAPDH與糖化作用
試驗(yàn)研究
    第二章 酵母雙雜交篩選與NS5B相互作用的宿主蛋白
        2.1 材料
            2.1.1 菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒
            2.1.2 主要試劑
            2.1.3 儀器設(shè)備
        2.2 方法
            2.2.1 載體構(gòu)建
            2.2.2 互作蛋白的篩選
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果
            2.3.2 酵母菌落PCR鑒定
            2.3.3 誘餌蛋白對(duì)酵母細(xì)胞毒性的檢測(cè)
            2.3.4 誘餌蛋白對(duì)酵母細(xì)胞自激活性的檢測(cè)
            2.3.5 陽性克隆篩選結(jié)果
            2.3.6 陽性克隆的PCR鑒定
            2.3.7 測(cè)序結(jié)果
            2.3.8 酵母回返試驗(yàn)對(duì)蛋白互作的驗(yàn)證
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第三章 豬瘟病毒NS5B與宿主蛋白相互作用鑒定
        3.1 材料
            3.1.1 細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒
            3.1.2 主要試劑
            3.1.3 儀器設(shè)備
        3.2 方法
            3.2.1 載體構(gòu)建
            3.2.2 真核重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染與表達(dá)結(jié)果驗(yàn)證
            3.2.3 原核重組質(zhì)粒的表達(dá)與表達(dá)結(jié)果檢測(cè)
            3.2.4 GST-Pulldown驗(yàn)證NS5B與GAPDH的相互作用
            3.2.5 激光共聚焦驗(yàn)證NS5B與GAPDH的相互作用
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果
            3.3.2 真核重組質(zhì)粒的表達(dá)鑒定結(jié)果
            3.3.3 原核重組質(zhì)粒的表達(dá)鑒定結(jié)果
            3.3.4 GST-Pulldown驗(yàn)證NS5B與GAPDH相互作用
            3.3.5 激光共聚焦驗(yàn)證NS5B與GAPDH的相互作用
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)介

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