發(fā)布時(shí)間：2020-10-18 05:51

　　 本實(shí)驗(yàn)旨在探討不同濃度外源褪黑素對(duì)冷凍后卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響。首先,小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞采用OPS法玻璃化冷凍保存,解凍后在含不同濃度(0mol/L,10-9 mol/L,10-7 mol/L,10"5 mol/L,10-3 mol/L)褪黑素的M2液中培養(yǎng)1h,然后檢測(cè)卵母細(xì)胞中ROS和GSH水平,孤雌激活后的胚胎發(fā)育能力和囊胚細(xì)胞數(shù)；并檢測(cè)了3組不同濃度(0 mol/L,10-7 mol/L,1O-3 mol/L)的褪黑素處理后的卵母細(xì)胞內(nèi)5種基因(Hsp90aal, Hsfl, Hspa1b, Nrf2和Bcl-xl)的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如下：(1)玻璃化冷凍解凍后的卵母細(xì)胞在含褪黑素的M2液中培養(yǎng)1 h,ROS水平只有10-3 mol/L褪黑素添加組顯著低于未添加組(P0.05),GSH水平在所有添加褪黑素組與未添加組之間無顯著差異(P0.05)。(2)玻璃化冷凍解凍后的卵母細(xì)胞在含褪黑素的M2液中培養(yǎng)1 h,經(jīng)孤雌激活,孤雌激活胚發(fā)育到2-細(xì)胞胚胎的能力隨著添加褪黑素的濃度增加而降低,而10-9～10-5 mol/L的褪黑素添加組與未添加組無顯著差異(P0.05),只有10-3 mol/L添加組卵裂率顯著低于未添加組(P0.05)；孤雌激活胚發(fā)育到囊胚的能力不隨添加褪黑素的濃度增加而改變(P0.05)。囊胚細(xì)胞數(shù)隨添加褪黑素的濃度增加而降低,但差異不顯著(P0.05)。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),10-3 mol/L和10-7 mol/L褪黑素添加組與未添加組都能檢測(cè)到Hsp90aal, Hsfl, Hspa1b, Nrf2和Bcl-xl的表達(dá)。10-3 mol/L的添加組5種基因的表達(dá)量都比未添加組低,且Hsf1、Hsp90aa1和Bcl-xl差異顯著；且與10-7 mol/L的添加組相比,Hsp90aa1和Bcl-xl差異也顯著。10"7 mol/L的添加組與未添加相比,Hspa1b和Hsf1表達(dá)量稍低,差異不顯著(P0.05)；Nrf2、Hsp90aa1和Bcl-xl表達(dá)量上調(diào),但只有Hsp90aal差異顯著(P0.05)。(4)體外受精實(shí)驗(yàn)表明,冷凍會(huì)使卵母細(xì)胞的卵裂率和囊胚率顯著低于新鮮組(Fresh)(P0.05),添加10-7 mol/L的褪黑素對(duì)卵母細(xì)胞的卵裂率和囊胚率沒有影響(P0.05)。因此,小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞超低溫冷凍解凍后培養(yǎng)1h添加的不同濃度的(10-9, 10-7,10-5,10-3 mol/L)褪黑素,對(duì)卵母細(xì)胞的后續(xù)發(fā)育能力沒有明顯改善。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S814
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文符號(hào)說明
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 褪黑素在動(dòng)物配子發(fā)生與胚胎發(fā)育中的作用
        1.1.1 哺乳動(dòng)物松果體中褪黑素的生物合成和釋放
        1.1.2 褪黑素受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程
        1.1.3 褪黑素在動(dòng)物生殖中作用
        1.1.4 褪黑素有利于精子發(fā)生及異常條件下的損傷修復(fù)
        1.1.5 褪黑素可促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟與發(fā)育
        1.1.6 褪黑素可提高早期胚胎發(fā)育質(zhì)量
    1.2 哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞超低溫冷凍保存
        1.2.1 卵母細(xì)胞冷凍的意義
        1.2.2 卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍
        1.2.3 卵母細(xì)胞冷凍損傷及解決措施
    1.3 褪黑素在緩解卵母細(xì)胞超低溫冷凍損傷方面存在潛在價(jià)值
    1.4 本實(shí)驗(yàn)的目的意義
2 材料方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2.2 試劑和儀器設(shè)備
        2.2.1 主要試劑
        2.2.2 主要儀器設(shè)備
        2.2.3 溶液配制
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 卵母細(xì)胞收集
        2.3.2 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍和解凍
        2.3.3 小鼠附睪精子采集和體外受精
        2.3.4 ROS和GSH檢測(cè)
        2.3.5 卵母細(xì)胞激活和胚胎培養(yǎng)
        2.3.6 囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)
        2.3.7 定量PCR
        2.3.8 統(tǒng)計(jì)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 褪黑素添加與冷凍小鼠卵母細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)
    3.2 褪黑素添加與冷凍小鼠卵母細(xì)胞孤雌激活后的胚胎發(fā)育
    3.3 褪黑素添加與冷凍小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)
    3.4 褪黑素添加與對(duì)冷凍小鼠卵母細(xì)胞IVF后胚胎的發(fā)育
4 討論
    4.1 褪黑素對(duì)冷凍小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)ROS的影響
    4.2 褪黑素對(duì)冷凍小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)GSH的影響
    4.3 褪黑素對(duì)冷凍小鼠卵母細(xì)胞孤雌激活后胚胎發(fā)育的影響
    4.4 褪黑素對(duì)冷凍小鼠卵母細(xì)胞基因表達(dá)的影響
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附表
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄

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