發(fā)布時(shí)間：2020-10-17 09:35

　　 【目的】本研究利用shRNA技術(shù)敲低p53、利用CRISPR/cas技術(shù)敲除Tp53,并利用外源過(guò)表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)p53等方法,通過(guò)構(gòu)建Tp53基因敲除(Tp53~(-/-))細(xì)胞系、培育Tp53基因敲除C57BL/6小鼠,旨在揭示p53在FMDV復(fù)制及對(duì)小鼠致病性中的生物學(xué)功能�！痉椒ā�(1)用FMDV處理PK-15細(xì)胞(porcine kidney 15 cell line)1h,用RNA-seq方法分析并用RT-qPCR(real-time quantitative polymerase chain reaction)驗(yàn)證以揭示宿主為對(duì)抗FMDV感染的早期反應(yīng)表達(dá)譜;(2)以BHK-21與PK-15細(xì)胞為材料,用MG132與MDM2抑制劑等藥物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,再用RT-qPCR與WB(western blotting)方法檢測(cè)FMDV感染與未感染細(xì)胞中p53在mRNA和蛋白水平的表達(dá),確定FMDV對(duì)BHK-21與PK-15細(xì)胞中p53的影響及相應(yīng)通路;(3)利用shRNA(short hairpin RNA)技術(shù)敲低BHK-21細(xì)胞中Tp53基因的表達(dá),然后用FMDV對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理,研究p53表達(dá)下調(diào)對(duì)FMDV復(fù)制的影響;(4)將構(gòu)建并測(cè)序鑒定的Tp53基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒HA-Tp53與Flag-Tp53轉(zhuǎn)入BHK-21細(xì)胞中,WB方法確定p53表達(dá)上調(diào)后用FMDV進(jìn)行處理,檢測(cè)外源p53過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)FMDV復(fù)制的影響;(5)利用CRISPR/cas9系統(tǒng)構(gòu)建Tp53~(-/-)的BHK-21和PK-15細(xì)胞系并用WB與測(cè)序方法進(jìn)行鑒定,然后,利用敲除成功的細(xì)胞系研究p53對(duì)FMDV在BHK-21和PK-15細(xì)胞中復(fù)制的影響;(6)利用購(gòu)買并繁育的Tp53~(-/-)的C57BL/6小鼠,研究FMDV對(duì)WT(wild type)與Tp53~(-/-)小鼠致死性;(7)利用生理鹽水、輕揉震蕩法分離WT與Tp53-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(rat peritoneal macrophages,RPMφ),培養(yǎng)貼壁后進(jìn)行FMDV進(jìn)行處理,用RT-qPCR方法檢測(cè)各細(xì)胞因子的表達(dá)情況;(8)1月齡WT與Tp53-/-小鼠分別用FMDV(100LD_(50))處理72h,然后取心臟、脾臟和肌肉固定于4%多聚甲醛中,然后用HE染色方法分析Tp53基因敲除對(duì)FMDV致病性的影響�！窘Y(jié)果】(1)經(jīng)RNA-seq分析及RT-qPCR驗(yàn)證,PK-15細(xì)胞經(jīng)FMDV處理1h時(shí)上調(diào)TNF、CXCL2、CCL20、CCL4和IL6等細(xì)胞因子以刺激炎癥反應(yīng)來(lái)對(duì)抗FMDV感染;(2)MG132實(shí)驗(yàn)表明FMDV感染1h內(nèi)通過(guò)泛素化通路抑制細(xì)胞p53在mRNA與蛋白水平的表達(dá),再經(jīng)MDM2抑制劑處理后發(fā)現(xiàn),FMDV在感染早期是通過(guò)非MDM2依賴的泛素化途徑抑制BHK-21中p53的表達(dá);(3)shRNA敲低Tp53基因的表達(dá)能夠抑制FMDV在BHK-21細(xì)胞中的復(fù)制;(4)外源HA-Tp53與Flag-Tp53過(guò)表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)p53表達(dá)后不能顯著影響FMDV在BHK-21細(xì)胞中的復(fù)制情況;(5)利用CRISPR/cas9系統(tǒng)成功獲得Tp53~(-/-)的BHK-21與PK-15細(xì)胞系,且發(fā)現(xiàn)在Tp53~(-/-)細(xì)胞系中FMDV復(fù)制受到抑制。此外,MDA5、RIG-I、TLR3在Tp53~(-/-)細(xì)胞系中被上調(diào);(6)相比于WT型C57BL/6小鼠,Tp53敲除小鼠在FMDV感染時(shí)存活率更高;(7)分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞并用FMDV感染,結(jié)果表明Tp53基因的敲除使IFNB-1、TNF、IL-6等發(fā)揮主要抗病毒功能的細(xì)胞因子表達(dá)被上調(diào);(8)HE病理切片結(jié)果顯示,與Tp53~(-/-)小鼠相比,FMDV對(duì)WT小鼠的病理?yè)p傷更嚴(yán)重�！窘Y(jié)論】在感染早期,FMDV經(jīng)非MDM2特異性泛素化-蛋白酶體途徑抑制p53的表達(dá),而宿主主要以炎癥反應(yīng)抵抗感染;長(zhǎng)期感染中,p53的敲除使IFNB-1、IRF-3、ISRE、TNF、IL6、RIG-I、MDA-5等的表達(dá)上調(diào)從而抑制FMDV的復(fù)制及其對(duì)小鼠的致病性。
【學(xué)位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

的疫苗接種對(duì)其他血清型幾乎沒(méi)有交叉保護(hù)作用。因此，選擇正確的疫苗來(lái)控制每至關(guān)重要[27]。蹄疫病毒（FMDV）概述口蹄疫病毒（FMDV）屬于小 RNA 病毒科中的口蹄疫病毒屬，并且具有直鏈 22 至 單股正鏈，非包膜 RNA 基因組。它因?yàn)椴《?RNA 依賴性 RNA 聚合酶缺乏校對(duì)能有高突變率[28]。因其具有較高的傳染率和實(shí)行國(guó)際貿(mào)易限制，口蹄疫被世界動(dòng)物織（國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE））規(guī)定為動(dòng)物必報(bào)疫病[18]。在牛犢、羊羔、小孩以中，F(xiàn)MDV 誘導(dǎo)的心肌損傷可能導(dǎo)致在任何囊泡發(fā)育前發(fā)生死亡[29]。FMDV 的基度超過(guò) 8000 個(gè)堿基，在其 5'-末端共價(jià)結(jié)合 23/24 氨基酸殘基基因組連鎖蛋白 3B[30]因組含有一個(gè)長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框（ORF），其有兩個(gè)不同的起始位點(diǎn)，并且它編碼的多可以被轉(zhuǎn)變?yōu)槭畮讉€(gè)成熟多肽以及多種部分切割的中間體[31-34]。該多聚蛋白裂解成 3 種病毒結(jié)構(gòu)蛋白（VP0，VP3，VP1）以及 8 種非結(jié)構(gòu)蛋白(L，2A，2B，2C，3A3C 和 3D)（見(jiàn)圖 1.1）。3C 蛋白酶是一種小 RNA 病毒的通用裂解酶。FMDV 衣殼前 可被 3C 蛋白酶切割，產(chǎn)生 VP0，VP3，VP1 和 2A[35]。

圖 1.3 p53 參與的細(xì)胞過(guò)程（引自 CJ Sherr 等）Fig. 1.3 p53 participated cellular processes (CJ Sherr, et al)2 負(fù)反饋調(diào)節(jié)自身穩(wěn)定性；通過(guò) Puma、Noxz、 BAX 參與凋亡調(diào)控；由 p21 等介導(dǎo)細(xì)介導(dǎo)參與衰老調(diào)控；通過(guò) Ercc5、Mgmt 等參與 DNA 損傷修復(fù)；通過(guò) TIGAR 參與新陳他因子介導(dǎo)的細(xì)胞過(guò)程。its own stability through negative feedback of MDM2; Puma, Noxz, BAX participate in apoptoregulated by p21; senescence regulation is regulated by PML and PAI-1; participating repair of, Mgmt, etc.; involvement in metabolism through TIGAR; and other factor-mediated cellular p

圖 1.4 p53 的信號(hào)通路（引自 BioCarta）Fig. 1.4 p53 Signaling Pathway (information provided by BioCarta)到損傷刺激時(shí)，p53 被磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核參與 GADD45、IGFBP3、BAX、p21 等介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯列細(xì)胞活動(dòng)。發(fā)揮玩功能后，為了維持其穩(wěn)定性，MDM2 等一系列細(xì)胞因子介導(dǎo) p53 出核轉(zhuǎn)運(yùn)并進(jìn)蛋白酶體降解途徑。lls are stimulated by injury, p53 is phosphorylated into the nucleus and participates in a series of cell activi, IGFBP3, BAX, p21 and other cell cycle arrest and DNArepair. In order to maintain its stability, a series osuch as MDM2 mediate p53 nuclear transport and enter the ubiquitination-proteasome degradation pathwa
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3 嚴(yán)亨秀;唐冬梅;付麗新;;抗FMDV基因疫苗的研究進(jìn)展[J];西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年04期

4 Qiao Xue;Huisheng Liu;Qiaoying Zeng;Haixue Zheng;Qinghong Xue;Xuepeng Cai;;The DEAD-Box RNA Helicase DDX1 Interacts with the Viral Protein 3D and Inhibits Foot-and-Mouth Disease Virus Replication[J];Virologica Sinica;2019年06期

5 高明;邵軍軍;林彤;趙付榮;劉澤眾;�；菔|;吳潤(rùn);;豬O型FMDV重組多表位抗原基因的克隆表達(dá)及免疫學(xué)鑒定[J];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2017年01期

6 FU Yuan-fang;LU Zeng-jun;TIAN Mei-na;ZHANG Xiao-li;LIU Zai-xin;CAI Xue-peng;;Expression of Major B-cell Epitopes within the 2C Non-structural Protein of FMDV and Their Immunoreactivity[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2009年S1期

7 ;A Simple and Rapid Colloidal Gold-based Immunochromatogarpic Strip Test for Detection of FMDV Serotype A[J];Virologica Sinica;2011年01期

8 ;Molecular Design and Immunogenicity of a Multiple-epitope FMDV Antigen and DNA Vaccination[J];Chemical Research in Chinese Universities;2008年01期

9 叢國(guó)正;周建華;高閃電;獨(dú)軍政;邵軍軍;林彤;�；菔|;謝慶閣;;攜帶FMDV前導(dǎo)蛋白基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及其在牛腎細(xì)胞中的表達(dá)[J];生物工程學(xué)報(bào);2008年05期

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本文編號(hào)：2844607