犬瘟熱(canine distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus,CDV)引起的一種病毒性傳染病,在全世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生。其傳統(tǒng)宿主主要包括大部分食肉目動(dòng)物。CDV感染犬科、貓科、浣熊科、鼬科、小熊貓科、大熊貓科已被多次報(bào)道。截至2013年年底,全國野生大熊貓種群數(shù)量達(dá)1864只,圈養(yǎng)大熊貓種群數(shù)量達(dá)到375只。2014年12月至2015年4月,陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心22只大熊貓中先后有6只CDV核酸檢測陽性,并且5只搶救無效相繼死亡。目前,RT-qPCR和膠體金試紙條是犬瘟熱最常用的檢測手段,但是RT-qPCR成本高、技術(shù)復(fù)雜、容易污染。而膠體金試紙條大多是針對感染犬的犬瘟熱病毒,并沒有針對犬瘟熱的試紙條。因此,有必要建立一種敏感性強(qiáng)且特異性好的犬瘟熱病毒檢測技術(shù),從而能夠準(zhǔn)確、快速地診斷感染大熊貓的犬瘟熱病毒,對保護(hù)我國珍稀動(dòng)物有著重大意義。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了犬瘟熱病毒樓觀臺毒株F蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)了犬瘟熱病毒融合蛋白胞外區(qū),以此作為抗原,制備了針對犬瘟熱病毒的單克隆抗體,然后用HRP標(biāo)記單克隆抗體,建立了針對犬瘟熱病毒雙抗體夾心ELISA方法。其結(jié)果如下:1.犬瘟熱病毒重組F蛋白的原核表達(dá)與純化參照犬瘟熱病毒樓觀臺毒株F蛋白的基因序列,構(gòu)建了包含犬瘟熱病毒F蛋白胞外區(qū)的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21(DE3),在37℃,1 mmol的IPTG的條件下誘導(dǎo)6 h,超聲裂解大腸桿菌,然后經(jīng)過Ni Resin親和層析,通過SDS-PAGE與Western Blot分析,CDV-F蛋白成功表達(dá),得到預(yù)期大小為40 Kda蛋白,并且表達(dá)的CDV-F蛋白具有良好的反應(yīng)原性,用經(jīng)純化的CDV-F蛋白免疫小鼠,通過采集小鼠血清進(jìn)行間接ELISA分析,小鼠血清的抗體滴度達(dá)到10~(-5),說明原核表達(dá)的CDV-F蛋白具有良好的免疫原性。2.單克隆抗體的制備、純化與HRP標(biāo)記用純化的CDV-F作為抗原,免疫BALB/c小鼠,利用傳統(tǒng)的細(xì)胞融合與亞克隆技術(shù)成功制備了三株單克隆抗體1A5,1A5和7D5,通過向腹腔注射雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體,收集腹水通過Protein G親和層析進(jìn)行純化,濃度分別為1.2 mg/mL,1.2 mg/mL,1.8 mg/mL。然后用氧化還原法標(biāo)記HRP,直接ELISA方法檢測三株抗體的效價(jià)為1∶100000-1∶1000000。3.犬瘟熱病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立首先利用犬瘟熱病毒作為抗原,通過競爭ELISA對單克隆抗體抗原表位進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,三株單克隆抗體均識別不同的表位,通過捕獲抗體與檢測抗體的確定,結(jié)果顯示1A5作為捕獲抗體,7D5-HRP作為檢測抗體時(shí)檢測病P/N值最高,非特異性反應(yīng)最弱,然后通過棋盤滴定法確定了雙抗體夾心ELISA方法的最佳反應(yīng)條件,其中捕獲抗體包被量為800 ng/孔、HRP-7D5稀釋比例為1∶100。4.敏感性評價(jià):用現(xiàn)有的商品化試紙條與雙抗體夾心ELISA方法分別犬瘟熱病毒感染的vero細(xì)胞的上清。結(jié)果顯示,兩種方法均能檢測到logTCID_(50)=1.8的病毒樣本,上述結(jié)果說明,建立的雙抗體夾心ELISA方法的敏感性與現(xiàn)有的商品化試紙條相同。5.特異性評價(jià):利用CPV(犬細(xì)小病毒)、ICHV(犬傳染性肝炎病毒)、CPIV(犬副流感病毒)三種病毒感染細(xì)胞的上清來評價(jià)雙抗體夾心ELISA方法的特異性。結(jié)果顯示,CPV、ICHV、CPIV細(xì)胞培養(yǎng)的上清均不反生反應(yīng),因此本方法具有良好的特異性。6.與商品化試紙條一致性評價(jià):13份臨床大熊血清與30份臨床犬血清分別用商品化試紙條與建立的雙抗體夾心ELISA方法檢測,臨床大熊貓血清中均沒有檢到犬瘟熱病毒,臨床犬血清兩種方法均檢到6份陽性,兩種方法的一致性為100%,說明雙抗體夾心ELISA方法與現(xiàn)有的商品試紙條一致性高。綜上所述,本課題建立了一種快速檢測犬瘟熱病毒的雙抗體夾心ELISA方法,與商品化試紙條具有很高的一致性,可以用來檢測犬瘟熱病毒。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

拍干酶標(biāo)板上殘留的液體；100 μL/孔的量加入新鮮配制的顯色液，室入 50 μL 的硫酸終止液終止反應(yīng)，藍(lán)色和 T-A 片段的擴(kuò)增以及陽性克隆驗(yàn)犬瘟熱病毒 F 基因胞外區(qū)序列，PCR 產(chǎn)物特異性目的條帶，和預(yù)期條帶的大小一致，將其連接至 pMD-19T（simple）克隆載含氨芐抗性的 LB 固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過夜培體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng) 3 h，通過菌液 PC）。

圖 2-2. 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化陽性克隆結(jié)果M: Trans2K Plus II DNA Maker；1、2: 陰性克��；3-10: 陽性克隆Fig. 2-2. products were transformed clones resultsM: 1Trans2K Plus II DNA Maker; 1,2: Negative clone; 3-10: Positive clon的片段和載體雙酶切鑒定經(jīng)PCR鑒定后為陽性克隆的質(zhì)粒，將其和pET-28a表達(dá)空載體用N雙酶切，經(jīng)過 1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，獲得的目的片段p 和 2300 bp，和預(yù)期結(jié)果相符（圖 2-3）。

圖 2-2. 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化陽性克隆結(jié)果K Plus II DNA Maker；1、2: 陰性克��；Fig. 2-2. products were transformed clones Plus II DNA Maker; 1,2: Negative clone; 3雙酶切鑒定陽性克隆的質(zhì)粒，將其和pET-28a表 1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，獲預(yù)期結(jié)果相符（圖 2-3）。
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本文編號：2844268