H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在我國(guó)呈地方流行性。近年來,優(yōu)勢(shì)流行的S基因型H9N2亞型AIV頻繁為包括H5N1、H7N9和H10N8在內(nèi)的新型重組AIV提供內(nèi)部基因。這些新出現(xiàn)的AIV可同時(shí)感染家禽與人類,H9N2亞型AIV在雞群中的穩(wěn)定流行是對(duì)家禽養(yǎng)殖與公共衛(wèi)生的雙重威脅。此外,H7N9亞型AIV目前在我國(guó)禽群中流行范圍越來越大,且出現(xiàn)了高致病性的變異病毒,造成了家禽嚴(yán)重的疫病爆發(fā),并對(duì)人類健康也帶來了巨大的威脅。目前禽流感的防控主要使用滅活疫苗,但是存在疫苗接種費(fèi)時(shí)費(fèi)力、毒力殘留、不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫等缺點(diǎn)。因此,研制禽流感弱毒活疫苗十分必要。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)屬于血清1型禽副粘病毒(Avian paramyxovirus serotype-1,APMV-1),其作為禽病疫苗載體已表達(dá)了多個(gè)病原體的保護(hù)性抗原,并獲得了較好的免疫效果。但我國(guó)商品雞群中新城疫(Newcastle disease,ND)母源抗體水平高,限制了 NDV載體化疫苗的使用。為解決NDV載體疫苗受母源抗體干擾的難題,本研究以NDV為骨架,將與NDV無血清學(xué)交叉反應(yīng)的血清2型禽副粘病毒(Avian paramyxovirus serotype-2,APMV-2)的主要抗原蛋白,即融合蛋白(Fusion Protein,F)和血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(Hemagglutinin-Neuraminidase Protein,HN)的胞外區(qū)替換到NDV基因組的對(duì)應(yīng)部分,獲得了一株重組嵌合NDV。在此基礎(chǔ)上,再以該嵌合NDV為載體表達(dá)當(dāng)前H7N9和H9N2亞型禽流感流行株的血凝素(hemagglutinin,HA)基因,進(jìn)而研制出了適合我國(guó)商品雞群使用的H7N9和H9N2亞型禽流感重組活疫苗。1.一株禽副粘病毒血清2型毒株的全基因測(cè)序和生物學(xué)特性鑒定根據(jù)GenBank中提供的APMV-2基因組序列,設(shè)計(jì)10對(duì)引物對(duì)APMV-2分離株(APMV-2/T4)進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增和測(cè)序,經(jīng)序列拼接后獲取了該毒株完整的基因組序列。序列分析顯示,APMV-2/T4與GenBank中公布的其他APMV-2毒株的基因組序列同源性為68.1～77.6%,F和HN蛋白的氨基酸序列同源性分別為69.5～78.3%和67.5～78.9%。全基因組、F基因和HN基因系統(tǒng)進(jìn)化分析均表明,APMV-2/T4與3株APMV-2中國(guó)分離株屬于基因II型。APMV-2/T4株基因組具有NDV相似的基因組結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄控制元件。其F蛋白的裂解位點(diǎn)(91 DKPASR↓F 97)具有不連續(xù)的堿性殘基,與NDV弱毒株的裂解位點(diǎn)相似。APMV-2/T4株生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果顯示,APMV-2/T4毒株能夠在雞胚中高效復(fù)制且對(duì)SPF雞無致病力,安全性良好。ND母源抗體陽(yáng)性的商品雞和SPF雞免疫APMV-2/T4后,產(chǎn)生的HI抗體的水平相當(dāng),免疫3周后HI效價(jià)均可達(dá)7log2,證明APMV-2/T4在存在ND抗體的情況下,能在雞體內(nèi)復(fù)制并且能夠有效地誘導(dǎo)抗體應(yīng)答。2.嵌合新城疫病毒載體的構(gòu)建及抗新城疫母源抗體干擾能力的評(píng)價(jià)根據(jù)APMV-2/T4的基因組序列預(yù)測(cè)F和HN蛋白的胞外區(qū),并將其替換到基因VIId亞型NDV致弱株AI4基因組的對(duì)應(yīng)位置。通過反向遺傳技術(shù)成功拯救了嵌合病毒AI4-T4FHN。將AI4-T4FHN連續(xù)傳代10次,嵌合病毒能夠穩(wěn)定地在雞胚中高效復(fù)制并且毒力較弱。交叉HI實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,重組嵌合病毒與抗APMV-2的多抗血清的反應(yīng)性強(qiáng),而與抗NDV的多抗血清反應(yīng)性較弱,證明嵌合病毒與NDV之間存在明顯的抗原性差異。為了評(píng)價(jià)重組嵌合病毒抗ND母源抗體干擾的能力,我們分別以AI4-T4FHN和LaSota活疫苗免疫1日齡商品雞(ND抗體效價(jià)為81og2)和SPF雞。AI4-T4FHN感染后未觀察到任何臨床癥狀與病理學(xué)損傷,且病毒很快被清除,顯示了其作為疫苗載體的安全性。血清學(xué)轉(zhuǎn)化測(cè)定顯示,在SPF雞中,LaSota活苗和嵌合病毒AI4-T4FHN誘導(dǎo)產(chǎn)生的HI抗體水平相當(dāng),均在7.21og2左右;相反,AI4-T4FHN在商品雞中產(chǎn)生的HI抗體水平為7.01og2,明顯高于LaSota誘導(dǎo)的HI滴度(3.2log2),表明LaSota活苗受ND母源抗體影響較大,而嵌合病毒AI4-T4FHN在高水平ND母源抗體的商品雞中仍然能夠有效誘發(fā)抗體免疫,顯示其不受ND母源抗體干擾。3.表達(dá)H7N9亞型禽流感病毒HA蛋白的嵌合新城疫病毒的構(gòu)建及免疫效力為開發(fā)新型H7N9亞型AIV活疫苗,本研究分別以嵌合NDV(AI4-T4FHN)和NDV致弱株AI4為骨架,擴(kuò)增H7N9亞型AIV的HA基因并將其中與NDV基因終止信號(hào)的相似序列(11i5AGAAAAAA1192)通過沉默突變的方式去除,將HA基因插入載體病毒基因組磷蛋白(phosphoprotein,P)和基質(zhì)蛋白(matrix protein,M)基因之間,用反向遺傳技術(shù)成功拯救出重組病毒AI4-T4FHN-H7和AI4-H7。重組病毒的生物學(xué)特性評(píng)價(jià)顯示病毒在雞胚中均具有較強(qiáng)的復(fù)制能力。Western blot和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(Indirect immunofluorescentassay,IFA)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在重組病毒感染的細(xì)胞中能夠檢測(cè)到HA蛋白,說明HA蛋白能夠在載體中穩(wěn)定表達(dá)。為了提高免疫后H7N9特異性抗體水平,本研究使用兩種免疫策略,即用嵌合載體疫苗AI4-T4FHN-H7進(jìn)行1日齡商品雞的初次免疫,2周后分別以同源病毒AI4-T4FHN-H7和異源病毒AI4-H7加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫2周后發(fā)現(xiàn),異源疫苗加免組的HI抗體效價(jià)是同源加免組的1.5倍,但免疫組H7N9特異性HI抗體均較低。用ELISA檢測(cè)針對(duì)H7N9的抗體水平,結(jié)果顯示,疫苗免疫后能夠有效誘導(dǎo)較高水平的H7N9特異性的IgY抗體。攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種免疫方式都能夠完全抵抗高致病性H7N9病毒的攻擊,但是異源載體加免組排毒動(dòng)物數(shù)量少于同源載體加免組且排毒的時(shí)間更短。上述結(jié)果表明,以嵌合載體疫苗AI4-T4FHN-H7進(jìn)行初免,AI4-H7進(jìn)行加強(qiáng)免疫的免疫策略能夠在商品雞中提供針對(duì)高致病性H7N9病毒攻擊的有效保護(hù)。4.表達(dá)H9N2亞型禽流感病毒HA蛋白的嵌合新城疫病毒的構(gòu)建及免疫效力以嵌合病毒AI4-T4FHN和NDV致弱株AI4為載體,將H9N2亞型AIV的HA蛋白插入載體病毒P和M基因之間,并成功拯救了重組病毒。重組病毒AI4-T4FHN-H9和AI4-H9在雞胚中有較高的復(fù)制效率并且對(duì)雞有很好的安全性。Western blot和IFA實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明HA蛋白能夠在載體中穩(wěn)定表達(dá)。AI4-T4FHN-H9在具有較高ND抗體水平的雞中能有效誘導(dǎo)針對(duì)H9N2特異性的HI抗體,且能夠顯著減少H9N2攻毒后的排毒量。為評(píng)價(jià)AI4-T4FHN-H9在商品雞中的免疫效果,分別以AI4-T4FHN-H9和AI4-H9對(duì)10日齡商品雛雞進(jìn)行免疫。AI4-T4FHN-H9能夠克服ND母源抗體對(duì)載體病毒的干擾,誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的載體特異性抗體。此外,AI4-T4FHN-H9免疫組的H9N2特異性HI抗體水平在免疫后3周顯著高于AI4-H9組和對(duì)照組,該重組病毒的成功構(gòu)建為H9亞型禽流感新型疫苗的研制提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號(hào)說明
綜述 新城疫病毒疫苗載體研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
第一章 一株禽副粘病毒血清2型毒株的全基因測(cè)序和生物學(xué)特性檢測(cè)
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
    參考文獻(xiàn)
第二章 嵌合新城疫病毒載體的構(gòu)建及其抗新城疫母源抗體干擾能力的評(píng)價(jià)
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
    參考文獻(xiàn)
第三章 表達(dá)H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的嵌合疫苗的構(gòu)建和免疫評(píng)價(jià)
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
    參考文獻(xiàn)
第四章 表達(dá)H9N2亞型禽流感病毒血凝素蛋白的嵌合疫苗的構(gòu)建和免疫評(píng)價(jià)
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
    參考文獻(xiàn)
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