豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是一種引起以母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病為典型特征的免疫抑制性疾病。1987年豬繁殖呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)在美國(guó)被首次發(fā)現(xiàn),短短數(shù)年P(guān)RRS疫情席卷全球,造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV基因組易變異,且具有免疫逃逸能力。獸醫(yī)臨床雖然通過(guò)各種措施進(jìn)行防控,但效果不佳,PRRS抗病育種成為解決PRRS問(wèn)題的重要出路。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)通城豬對(duì)PRRS具有較強(qiáng)的抗病性,針對(duì)通城豬的抗病性已經(jīng)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和與微小RNA(MicroRNA,miRNA)水平的研究,發(fā)現(xiàn)了大量的差異表達(dá)mRNA和miRNA。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)在抗病毒免疫過(guò)程中扮演了重要的調(diào)控角色,LncRNA可以通過(guò)調(diào)控mRNA或者miRNA來(lái)影響病毒的增殖。本研究擬對(duì)通城豬和大白豬,PRRSV人工感染前后的脾臟和腹股溝淋巴結(jié)中差異表達(dá)LncRNA進(jìn)行研究,為揭示LncRNA在宿主抗PRRSV免疫應(yīng)答中發(fā)揮的作用和PRRSV的抗病育種奠定基礎(chǔ)。取得的主要結(jié)果如下:1.通城豬和大白豬PRRSV感染前后,脾臟和腹股溝淋巴結(jié)中LncRNA差異表達(dá)分析以通城豬和大白豬PRRSV人工感染前后的脾臟和腹股溝淋巴結(jié)的RNA-seq數(shù)據(jù)為材料,通過(guò)使用FastQC、Tophat2、Cufflinks系列軟件與LncRNA轉(zhuǎn)錄本篩選和差異表達(dá)分析流程,進(jìn)行了通城豬和大白豬PRRSV感染前后脾臟與腹股溝淋巴結(jié)中LncRNA的鑒定與差異表達(dá)分析。發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后均引起通城豬和大白豬LncRNA差異表達(dá)。在脾臟中,鑒定出通城豬感染后差異表達(dá)LncRNA 441條,鑒定出大白豬感染后差異表達(dá)LncRNA 695條,同時(shí)兩品種脾臟中本底表達(dá)LncRNA有1744條呈現(xiàn)出品種間遺傳差異;在腹股溝淋巴結(jié)中,鑒定出通城豬感染后差異表達(dá)LncRNA1602條,鑒定出大白豬感染后差異表達(dá)LncRNA 777條,同時(shí)兩品種腹股溝淋巴結(jié)中本底表達(dá)LncRNA有282條呈現(xiàn)出品種間遺傳差異。2.參與PRRSV免疫應(yīng)答和抗病毒通路調(diào)控的LncRNA的篩選對(duì)上述分析得到的PRRSV感染后差異表達(dá)LncRNA,通過(guò)三種途徑來(lái)篩選參與宿主對(duì)PRRSV免疫應(yīng)答的候選LncRNA。第一種途徑,使用權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)構(gòu)建PRRSV感染后差異表達(dá)LncRNA與差異表達(dá)mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和模塊,導(dǎo)入病毒載量信息,關(guān)注PRRSV免疫應(yīng)答關(guān)鍵模塊中與病毒載量相關(guān)性高的LncRNA。通過(guò)這種篩選共得到59條候選LncRNA;第二種途徑,聚焦PRRSV感染后差異表達(dá)倍數(shù)排前10%的極端差異LncRNA,選出通城豬與大白豬脾臟和腹股溝淋巴結(jié)中PRRSV感染后極端差異LncRNA共109條;第三種途徑,根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道參與PRRSV免疫應(yīng)答的基因與miRNA,反向逆推與之相關(guān)的LncRNA。通過(guò)這種篩選得到了4條與PRRSV免疫應(yīng)答相關(guān)基因共定位的LncRNA,71條與PRRSV免疫應(yīng)答相關(guān)miRNA有結(jié)合位點(diǎn)的LncRNA。通過(guò)對(duì)候選LncRNA分析發(fā)現(xiàn),三種不同途徑均可篩選出LncRNA ALDB4471。ALDB4471與抗PRRSV基因RSAD2重疊,并且表達(dá)量與病毒載量呈正相關(guān),是PRRS相關(guān)關(guān)鍵模塊中與病毒載量相關(guān)性排前10%的LncRNA,而且ALDB4471在通城豬和大白豬PRRSV感染后脾臟與腹股溝淋巴結(jié)中均極端上調(diào)。3.ALDB4471的功能研究通過(guò)RACE試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了RSAD2的未注釋新轉(zhuǎn)錄本,命名為RSAD2?。ALDB4471與RSAD2?的3’末端重疊。構(gòu)建ALDB4471真核表達(dá)載體,在細(xì)胞中超表達(dá)ALDB4471后進(jìn)行PRRSV感染實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn),超表達(dá)ALDB4471可以顯著抑制細(xì)胞中RSAD2的表達(dá),并且顯著促進(jìn)PRRSV復(fù)制。為了研究ALDB4471與RSAD2的關(guān)系,使用Poly(I:C)誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞中RSAD2的表達(dá),然后超表達(dá)ALDB4471,發(fā)現(xiàn)ALDB4471可以顯著抑制RSAD2的表達(dá)。通過(guò)RPIseq與catRAPID網(wǎng)站預(yù)測(cè)ALDB4471與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況發(fā)現(xiàn),ALDB4471可以與轉(zhuǎn)錄因子p53結(jié)合,而且目前研究表明p53可以促進(jìn)RSAD2的表達(dá)。所以提出猜想,ALDB4471可以通過(guò)與RSAD2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子p53,從而使RSAD2表達(dá)受到抑制。本研究主要完成了通城豬和大白豬感染PRRSV后脾臟與腹股溝淋巴結(jié)中LncRNA的鑒定與差異表達(dá)分析;通城豬與大白豬品種間差異表達(dá)LncRNA的鑒定與分析;參與PRRSV免疫應(yīng)答的LncRNA的篩選與功能驗(yàn)證。這些研究使我們對(duì)通城豬和大白豬抗PRRSV免疫應(yīng)答的LncRNA水平差異有了更深入的了解。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了參與PRRSV免疫應(yīng)答的LncRNA ALDB4471,為PRRSV的抗病育種提供了參考。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S858.28
【部分圖文】：

細(xì)胞的殺菌能力，這在一定程度上解釋了 PRRSV 為何n et al, 2013）。細(xì)胞（natural killer cell NK）是天然免疫系統(tǒng)中的重要染性病原體與自身惡性腫瘤細(xì)胞，NK 可以裂解被感染經(jīng)被證明可以抑制 PRRSV 的復(fù)制（Bautista and MolitorSV 會(huì)抑制 NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，導(dǎo)致被感染細(xì)胞難以s 是在胸腺中發(fā)育的一種 T 淋巴細(xì)胞，與 T 細(xì)胞不同的呈遞細(xì)胞（Aps）的抗原呈遞（Piguet et al, 1999）。 T 有細(xì)胞毒活性，還可以分泌 IFN （Stepanova and Sinkora 感染會(huì)抑制 T Cells 分泌 IFN 。（圖 1-1）簡(jiǎn)要概括了各的情況下發(fā)生的變化。

甚至在中和抗體產(chǎn)生之前，成年宿主的病毒血癥已經(jīng)康復(fù)，但是豬仔病毒血癥還在持續(xù)。這種現(xiàn)象暗示了，病毒的清除也許是通過(guò)體液免疫以外的途徑，可能是先天性免疫或者細(xì)胞免疫。宿主感染 PRRSV 后的適應(yīng)性免疫主要以體液免疫產(chǎn)生的中和性抗體，細(xì)胞免疫效應(yīng) T 細(xì)胞（CTLs）為主。有研究表明無(wú)論是仔豬或者成年豬，感染 PRRSV 后約 4 周才能產(chǎn)生中和抗體，隨著中和抗體的產(chǎn)生，病毒血癥與組織病毒載量持續(xù)下降（圖 1-2）（Lopez et al, 2007; Yoo et al, 2010）。中和抗體產(chǎn)生的推遲主要是由于PRRSV 的結(jié)構(gòu)蛋白 Gp5 存在高頻率的突變與糖基化現(xiàn)象，并且 Gp5 存在誘騙性的抗原表位，使免疫系統(tǒng)無(wú)法產(chǎn)生正確的中和抗體（Balasuriya and MacLachlan ，2004）遺憾的是對(duì)于 PRRSV 感染條件下 CTLs 的研究很少，有報(bào)道顯示 CTLs 在 PRRSV感染的宿主中非常微弱（Costers et al, 2009）。因此對(duì)于 PRRSV 感染下的細(xì)胞免疫還需要更深入的研究。

圖 1-3 LncRNA 分類與各種調(diào)控機(jī)制 （Salviano-Silva et al, 2018）Fig. 1-3 LncRNA classification and various regulatory mechanisms1.2.2.2 LncRNA 在宿主抗病毒免疫中的研究進(jìn)展宿主抗病毒免疫中的起作用的 LncRNA 也被廣泛報(bào)道，這些 LncRNA 可以參與轉(zhuǎn)錄因子激活，IFN 等細(xì)胞因子的產(chǎn)生和 ISGs 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等過(guò)程（Ouyang et al, 2016）（圖 1-4）。LncRNACMPK2 與 NRAV 都被證明可以抑制干擾素調(diào)節(jié)通路，干擾 ISGs的轉(zhuǎn)錄（Ouyang et al, 2014）。LncRNANEAT1 可以通過(guò)誘導(dǎo) IL8 來(lái)促進(jìn)多種抗病毒基因的表達(dá)，最終抑制 HIV 的蛋白質(zhì)合成（Zhang et al, 2013;Imamura et al, 2014）。LncRNA NKILA 可以通過(guò)阻斷 NF- B 抑制因子 I B 失活來(lái)抑制 NF- B 入核，使得NF- B 的下游免疫通路無(wú)法正常激活（Liu et al, 2015）。由此可見(jiàn) LncRNA 在宿主抗病毒免疫中起到重要的調(diào)控作用，很多抗病毒 LncRNA 被當(dāng)做生物學(xué)標(biāo)記用于藥物開(kāi)發(fā)和疾病診斷。
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本文編號(hào)：2842792